GH_4C_1細胞におけるリソゾームシステインプロテアーゼの細胞内輸送機構について

关于溶酶体半胱氨酸蛋白酶在GH_4C_1细胞中的胞内转运机制

• 批准号: 07770016
• 负责人: 和栗 聡
• 金额: $ 0.51万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07770016/
• 关键词: GH_4C_1細胞; マンノース6ーリン酸レセプター; システインプロテアーゼ

(1)GH4C1細胞におけるMPR(mannose 6-phosphate receptor)の発現解析。CI(cation independent)およびCD(cation dependent)MPRの発現を解析するために、まずCDMPRの細胞質側領域のペプチドを合成し、これに対するポリクローナル抗体を作製した。そしてこの抗体が、免疫沈降法、蛍光抗体法に使用できることを確認した。RT-PCR、免疫沈降法、蛍光抗体法により、GH4C1細胞におけるMPRの発現を検索した結果、同細胞においてはCIMPRの発現がCDMPRに比して著しく低いことが明らかになった。そしてこのことが、私の見出した現象、すなわち同細胞においてシステインプロテアーゼがリソゾームだけでなく分泌顆粒にも局在し、細胞外へ分泌されることの説明となることが示唆された。また、内分泌系の他の培養細胞株として知られるAtT-20、PC12細胞およびラット下垂体組織にて同様の解析をした結果、PC12細胞ではGH4C1細胞とは逆にCIMPRがCDMPRより発現が強く、AtT-20細胞、ラット下垂体では両者が同程度に発現していることが確認された。このことは組織、細胞により両者の発現様式が異なることを示唆する。(2)GH4C1細胞へのMPR遺伝子導入。(1)の結果に基ずき、エレクトロポレーション法を用いてヒトCIMPR遺伝子をGH4C1細胞に遺伝子導入した。安定に発現する細胞株を得るためG418 Sulfateで選択し、蛍光抗体法にて発現を確認することにより、CIMPRを高率に発現するクローンが得られた。現在、この細胞におけるシステインプロテアーゼの局在および分泌動態の解析を行っている過程である。

（1）GH4C1细胞中MPR（甘露糖6-磷酸受体）的表达分析。为了分析CI（阳离子独立）和CD（阳离子依赖）MPR的表达，首先合成CDMPR的肽，并为此创建多克隆抗体。已经证实，该抗体可用于免疫沉积和荧光抗体方法。 RT-PCR，免疫沉积和荧光抗体方法已经搜索了GH4C1细胞中MPR的表达，表明CIMPR的表达明显低于CDMPR。有人提出，这是对我发现的现象的描述，即在细胞中，不仅在溶酶体中，而且在分泌颗粒中都占主导地位，而且在外部细胞中分泌。此外，由于ATT-20的类似分析，PC12细胞和大鼠垂体组织称为内分泌系统的其他培养细胞，CIMPR在PC12细胞中比CDMPR强，与GH4C1细胞相反。相同程度的ATT-20细胞和大鼠垂体。这表明两者的格式取决于组织和细胞。 （2）将MPR基因引入GH4C1细胞。根据（1）的结果，使用电穿孔方法将人CIMPR基因引入GH4C1细胞。为了获得稳定的细胞库存，通过选择G418硫酸盐并确认荧光抗体方法中的表达来表达CIMPR的克隆。当前，分析该细胞中半胱氨酸蛋白酶的局部和分泌动力学的过程。

项目成果

和栗聡: "ライソソームシステインプロテアーゼの局在の多様性" 生体の科学. 46. 243-249 (1995)

Satoshi Waguri：“溶酶体半胱氨酸蛋白酶的定位多样性”生物科学 46. 243-249 (1995)。

Tohru Nitatori: "Delayed neuronal death in the CA1 pyramidal cell layer of the gerbil hippocampus following transient ischemia is apotosis." Journal of Neuroscience. 15. 1001-1011 (1995)

Tohru Nitatori：“短暂性缺血后，沙鼠海马 CA1 锥体细胞层中的延迟性神经元死亡就是细胞凋亡。”

Takeshi Shibahara: "The fate of effete epithelial cells at the villus tips of the human small intestine." Archives of Histology and Cytology. 58. 205-219 (1995)

Takeshi Shibahara：“人类小肠绒毛尖端无效上皮细胞的命运。”

Satoshi Waguri: "Cysteine proteinases in GH4C1 cells,a rat poituitary tumor cell line,are secreted by the constitutive and regulated secretory pathways." European Journal of Cell Biology. 67. 308-318 (1995)

Satoshi Waguri：“大鼠垂体肿瘤细胞系 GH4C1 细胞中的半胱氨酸蛋白酶由组成型和调节性分泌途径分泌。”