日周リズムからみたラット肝組織におけるシステインプロテアーゼmRNAの発現と局在

从昼夜节律角度观察大鼠肝组织中半胱氨酸蛋白酶mRNA的表达及定位

• 批准号: 05770017
• 负责人: 和栗 聡
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Iwate Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05770017/
• 关键词: ラット; 肝細胞; クッパー細胞; カテプシンB; カテプシンH; カテプシンL; 日周リズム

リソゾームの代表的なシステインプロテアーゼとして知られるカテプシンB、H、Lの発現調節を検索する目的で、In situ hybridization法およびNorthern blotting法を用い、ラット肝組織中におけるこれら酵素mRNAの日周リズムの解析を試みた。1.Northern blotting:プローブとして、ジゴキシゲニン標識したリボプローブ、および^<32>P標識したcDNAプローブを用い、まず予備実験として16時(明期の後期:タンパクレベルで最も発現が高い時間)のラット肝RNAについて解析した。その結果、各酵素に対応したRNAが検出されたが、ジゴキシゲニン標識を用いた方がバックグランドが高かったため、^<32>P標識したcDNAプローブを用いて日周リズムを解析した。24時間を6時点に分けて比較した結果、各酵素のmRNAは16時にピークとなるリズムを示したが、有意差は見られなかった。これはクッパー細胞におけるこれら酵素の発現が非常に高いためと思われる。そこでIn situ hybridization法にて肝細胞のみの発現を検索した。2.In situ hybridization:プローブは実験の簡易性という点からジゴキシゲニン標識のリボプローブを使用した。その結果、主に肝細胞及びクッパー細胞に各酵素mRNAの陽性反応が見られ、それはクッパー細胞により強かった。しかし、肝細胞の反応を画像解析にて検索したところ、肝小葉内での分布に差は見られず、また日周リズムの解析でも、明瞭なリズムが見られなかった。現段階で、ジゴキシゲニン標識のリボプローブでは感度が低いことも考えられるため、現在^<35>Sで標識したプローブを用いて解析中である。

为了搜索称为溶酶体的代表性半胱氨酸蛋白酶的组织蛋白酶B，H和L的表达调节，我们试图使用原位杂交和北面印刷方法分析大鼠肝组织中这些酶mRNA的昼夜节律。 1。北印迹：作为探针，首先将二高素标记的核糖探针和A ^<32> p标记的cDNA探针分析为在4:00 pm的大鼠肝脏RNA上的初步实验（晚期光相：蛋白质水平的最高表达时间）。结果，检测到与每种酶相对应的RNA，但是使用标记为二高氧素时的背景较高，因此使用A ^<32> p标记的cDNA探针分析了昼夜节律。比较了24小时的6次结果，尽管每种酶的mRNA显示出4pm的峰值节奏，但发现没有显着差异。这可能是由于这些酶在库普弗细胞中的表达很高。因此，使用原位杂交方法搜索肝细胞的表达。 2。原位杂交：为了简单起见，探针是一种二高氧蛋白标记的核糖探针。结果，主要在肝细胞和库普弗细胞中观察到每个酶mRNA的阳性反应，这些反应比在库普弗细胞中强。但是，当使用图像分析搜索肝细胞反应时，在肝小叶中的分布中未发现差异，甚至对昼夜节奏的分析也没有明显的节奏。在此阶段，二氧素标记的肋骨探针的灵敏度很低，因此目前使用标记为 ^<35> s的探针进行了分析。

项目成果

Yoshiyuki Ohsawa: "Immunocytochemical localization of lysosomal cysteine and aspartic proteinases,acid phosphatase,and endogenous cysteine proteinase inhibitor,cystatin beta,in young and adult rat bone tissues." The Journal of The Iwate Medical Associatio

Yoshiyuki Ohsawa：“溶酶体半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶、酸性磷酸酶以及内源性半胱氨酸蛋白酶抑制剂、胱抑素β在年轻和成年大鼠骨组织中的免疫细胞化学定位。”

Yutaka Hashizume: "Cysteine proteinases in rat parathyroid cells with special reference to their correlation with parathyroid hormone (PTH) in storage granules." The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41. 273-282 (1993)

Yutaka Hashizume：“大鼠甲状旁腺细胞中的半胱氨酸蛋白酶，特别是它们与储存颗粒中的甲状旁腺激素 (PTH) 的相关性。”

Kohichiro Sano: "Coexistence of renin and cathepsin B in secretory granules of granular duct cells in male mouse submandibular gland." The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41. 433-438 (1993)

Kohichiro Sano：“雄性小鼠颌下腺颗粒管细胞分泌颗粒中肾素和组织蛋白酶 B 共存。”

Hideo Tokunaga: "Immunocytochemical localization of lysosomal cysteine and aspartic proteinases in rat and human bladder epithelium." The Journal of The Iwate Medical Association. (in press).

Hideo Tokunaga：“大鼠和人膀胱上皮中溶酶体半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶的免疫细胞化学定位。”