光学顕微鏡を用いたゴルジ体-エンドゾーム-細胞膜間輸送動態の定量化とその応用

使用光学显微镜定量高尔基体-内体-细胞膜运输动力学及其应用

• 批准号: 13770011
• 负责人: 和栗 聡
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13770011/
• 关键词: GFP; FRAP; IGF2; M6PR; トランスゴルジネットワーク; エンドゾーム; 2-コンパートメントモデル; コレステロール; fluorescence recovery after photobleaching

本研究では、インシュリン様成長因子2/マンノース6リン酸受容体(IGF2/M6PR)のポストゴルジ輸送、すなわちトランスゴルジネットワーク(TGN)、エンドゾーム、および細胞膜間輸送の動態を定量する方法を確立した。IGF2/M6PRと緑色蛍光蛋白(GFP)との融合蛋白(GFP-IGF2/M6PR)を細胞に発現させ、TGN領域の蛋白のみをレーザー光で消光させ、その後の同領域における蛍光の回復を測定した。この蛍光退色後回復法(FRAP法)を用いることで、GFP-IGF2/M6PRが細胞内のコンパートメント間を約40分で一巡することが分かった。また、細胞質外ドメインを欠いた融合蛋白はより短時間で一巡する傾向があることから、細胞質外ドメインの存在が正しいIGF2/M6PRの輸送に必要であることが示唆された。この結果を受けて、IGF2/M6PRの細胞質外ドメインの機能をさらに詳細に検討した。コレステロールの代謝や輸送を乱す薬物であるU18666Aを投与すると、IGF2/M6PRは細胞内の分布変化を示すが、細胞質外ドメインを欠いた変異蛋白は変化しなかった。従って、同薬剤が細胞質外ドメイン依存的な輸送経路の同定に有効であることが分かった。さらに、細胞質外ドメインのM6Pを含むリガンド群(主にリソソーム酵素)との結合部位を欠失させた変異蛋白もU18666Aの影響を受けなった。これらの結果は、IGF2/M6PRの輸送にはM6Pリガンドの結合に依存した経路が存在することを示すとともに、同経路にはコレステロールの代謝/輸送が関わることを示唆する。

在这项研究中，我们建立了一种方法来量化后高尔基传输的动力学，即跨加利基网络（TGN），内体和胰岛素样生长因子2/甘露糖6磷酸受体（IGF2/M6PR）的膜间传输。 IGF2/M6PR和绿色荧光蛋白（GFP）（GFP-IGF2/M6PR）之间的融合蛋白在细胞中表达，并且仅用激光光淬灭TGN区域中的蛋白质，并测量同一区域中荧光的随后恢复。通过使用这种荧光褪色恢复方法（FRAP方法），发现大约40分钟内细胞内隔室之间的GFP-IGF2/M6PR圆圈。此外，缺乏外胞质结构域的融合蛋白倾向于在较短的时间内流动，这表明正确运输IGF2/M6PR需要需要外胞浆外域的存在。为了响应这些结果，我们更详细地研究了IGF2/M6PR的外质域的功能。当施用U18666a（一种破坏胆固醇代谢和运输的药物）时，IGF2/M6PR会显示出细胞内分布的变化，但是缺乏外胞质外结构域的突变蛋白并未改变。因此，发现该药物有效地识别胞外域依赖性转运途径。此外，删除与含有外胞质外域M6P（主要是溶酶体酶）的配体的结合位点的突变蛋白也受U18666a的影响。这些结果表明，途径取决于IGF2/M6PR转运的M6P配体结合，并表明该途径涉及胆固醇代谢/转运。

项目成果

Waguri S: "Different distribution patterns of the two mannose 6-phosphate receptors in rat liver"J Histochem Cytochem. 49. 1397-1405 (2001)

Waguri S：“大鼠肝脏中两种甘露糖 6-磷酸受体的不同分布模式”J Histochem Cytochem。

Shibata M: "Cathepsin D is specifically inhibited by deoxyribonucleic acids"FEBS Lett. 517. 281-284 (2002)

Shibata M：“组织蛋白酶 D 被脱氧核糖核酸特异性抑制”FEBS Lett。

Waguri S: "Visualization of TGN to endosome trafficking through fluorescently labeled MPR and AP-1 in living cells"Mol Biol Cell. 14. 142-155 (2003)

Waguri S：“通过活细胞中荧光标记的 MPR 和 AP-1 实现 TGN 到内体运输的可视化”Mol Biol Cell。

Shinotsuka C: "Dominant-negative mutant of BIG2, an ARF-guanine nucleotide exchange factor, specifically affects membrane trafficking from the trans-Golgi network through inhibiting membrane association of AP-1 and GGA coat proteins"Biochem Biophys Res Co

Shinotsuka C：“BIG2（一种 ARF-鸟嘌呤核苷酸交换因子）的显性失活突变体，通过抑制 AP-1 和 GGA 外壳蛋白的膜结合，特异性影响跨高尔基体网络的膜运输”Biochem Biophys Res Co

Shibata M: "Cathepsin D is specifically inhibited by deoxyribonucleic acids"FEBS Lett. (in press).

Shibata M：“组织蛋白酶 D 被脱氧核糖核酸特异性抑制”FEBS Lett。