中枢神経系における多機能性糖蛋白質とそのペプチド性基質の局在性に関する研究

多功能糖蛋白及其肽底物在中枢神经系统定位的研究

基本信息

批准号：
06780521
负责人：
伊藤孝司
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

保護蛋白質は、リソソーム性糖質加水分解酵素であるβ-ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼの保護機能と、神経ペプチドなどのカルボキシ末端のカルボキシペプチダーゼあるいはデアミダーゼ活性を合わせ持つ多機能性糖蛋白質である。ガラクトシアリドーシスは、この蛋白のヒトの遺伝性欠損症であり、運動失調などの中枢神経障害をはじめとする極めて多様な臨床症状を示す。本年度は、保護蛋白質の酵素機能の、中枢神経系での生理的役割や機能との関連を解明する目的で研究を進め、以下に示す成果を得た。1.ヒト保護蛋白質を構成する日本のポリペプチド(分子量32kDaと20kDa)のそれぞれのN末およびC末端のオリゴペプチドに対するウサギポリクローナル抗体(抗32kDaN末および抗20kDaC末抗体)を作製した。これらの抗体を用いたイムノブロット法により、対照ヒト各臓器における保護蛋白質の分布を解析した結果、腎、肺、肝臓で含量が高く、脳では相対的に低いことが明らかになった。またその相対量はカルボキシペプチダーゼ活性と平行していた。2.精製した抗32kDaN末抗体を用いた酵素抗体法により、対照の各部位のヒト脳組織切片を免疫染色したところ、保護蛋白質は、運動野の大脳皮質の大型錐体細胞、小脳の歯状核、および脊髄の前角細胞などの神経細胞に局在することが明らかになった。一方、ガラクトシアリドーシス患者由来の組織では免疫交差物は検出されなかった。3.保護蛋白質/カルボキシペプチダーゼの天然基質の候補として、エンドセリン1に注目し、各臓器の可溶性抽出液中のエンドセリン1分解活性を測定した。この酵素活性も腎、肺、肝臓で高く、抗保護蛋白質抗体で免疫沈降した。またガラクトシアリドーシス患者由来の臓器では欠損していた。エンドセリン1の生理活性発現にはカルボキシ末端のトリプトファン残基が必須であることやエンドセリン1が精髄前角細胞に局在するという報告を考慮すると、生体内で保護蛋白質はエンドセリン1の分解酵素として機能し、その不活性化に関与している可能性が示唆された。

保护性蛋白是多功能糖蛋白，既具有溶酶体碳水化合物水解酶β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶的保护功能，又具有神经肽的羧基末端羧肽酶或脱酰胺酶活性。半乳糖唾液酸贮积症是这种蛋白质的人类遗传缺陷，表现出多种临床症状，包括共济失调等中枢神经系统疾病。今年，我们进行了旨在阐明保护蛋白的酶功能与中枢神经系统的生理作用和功能之间的关系的研究，并获得了如下结果。 1.针对构成人保护蛋白的日本多肽(分子量32kDa和20kDa)各自的N端和C端寡肽制备兔多克隆抗体(抗32kDa N端和抗20kDa C端抗体)。使用这些抗体通过免疫印迹分析对照人各器官中保护性蛋白的分布，结果表明，肾脏、肺和肝脏中的含量较高，而大脑中的含量相对较低。此外，其相对量与羧肽酶活性平行。 2.使用纯化的抗32kDa N端抗体对人脑组织切片进行酶联免疫染色，在运动皮质和齿状细胞的大脑皮层大锥体细胞中检测到保护蛋白研究表明，它位于小脑和神经细胞中，例如脊髓的腹角细胞。另一方面，在半乳糖唾液酸贮积症患者的组织中没有检测到免疫交叉反应物。 3. 着眼于内皮素 1 作为保护性蛋白/羧肽酶的天然底物候选物，我们测量了每个器官可溶性提取物中内皮素 1 的降解活性。这种酶在肾、肺和肝中的活性也很高，并且用抗保护性蛋白抗体进行免疫沉淀。来自半乳糖唾液酸贮积症患者的器官中也不存在这种物质。考虑到羧基末端色氨酸残基对于内皮素-1的生理活性至关重要，并且有报道称内皮素-1位于精液前角细胞中，因此该保护性蛋白可能作为内皮素-1的降解酶发挥作用。有人认为它可能参与其失活。