血液脳関門透過能をもつES細胞由来細胞株の樹立と脳内ターゲッティング機構

具有血脑屏障通透性和脑靶向机制的ES细胞来源细胞系的建立

基本信息

批准号：
18659023
负责人：
伊藤孝司
金额：
$ 1.98万
依托单位：
The University of Tokushima
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

1.Sandhoff病マウス由来株化ミクログリアの活性化機構及び脳内移行の解析Sandhoff病は、中枢神経障害を伴うリソソーム病の一種であり、β-Hexosaminidase(Hex)を構成するβ鎖遺伝子の変異が原因で、脳内のGM2ガングリオシド(GM2)の過剰蓄積を伴って発症する常染色体劣性遺伝病である。この疾患モデルマウス(SDマウス:Hexb-/-)の細胞治療およびex vivo遣伝子治療用のドナー細胞の開発を目的として、SDマウス脳由来の株化ミクログリアの性状と脳内移行能を解析した。1) 昨年度、SDミクログリアではGM2、GA2および末端GlcNAc含有オリゴ糖が細胞内に過剰蓄積し、Macrophage inflammatory factor-1(MIP-1α)の産生・分泌が充進していることを明らかにした。本年度は、この充進にPhospholipase C(PLC)、Protein kinase C(PKC)およびB(PKB or Akt)を介したシグナリングが関与し、MIP-1α遺伝子の転写およびタンパク質の分泌制御に異常があることを初めて明らかにした。2) マウスHexbと緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を含む組換えレンチウイルスを作製してSDミクログリアに遺伝子導入を行い、得られた恒常発現株を野生型マウスの尾静脈内に注入すると、一部が脳内に移行し、脳幹領域の実質内に侵入しており、脳移行性細胞としての機能を保持していることが明らかになった。2.マウス脳血管内皮細胞株由来ミクログリア誘引因子の解析血液脳関門を構成する脳血管内皮細胞と脳内移行能をもつミクログリアとの相互作用を解明する目的で、マウス脳血管内皮細胞株の培養上清中のマウスミクログリア誘引因子について解析した。1) マウス脳血管内皮細胞株(MBEC4)の培養上清中には、単球には作用しないが、ミクログリアの浸潤や遊走能を促進し、トリプシン感受性を示す液性因子が存在することを明らかにした。培養上清を株化ミクログリアに作用させたところ、CDllbの発現とアクチン重合が増大し、ミクログリアの活性化と運動能の充進が誘導された。2) MBEC4由来培養上清をゲルろ過により分離したところ、500kDa以上の高分子領域と5kDa付近の低分子領域にミクログリア誘引活性が検出され、培養上清では高分子タンパク複合体として存在する可能性が示唆された。3) 一方、血液脳関門を構成するアストロサイト由来の培養上清をMBEC4由来培養上清に混合すると、ミクログリア誘引活性は用量依存的に阻害され、アストロサイト由来のミクログリア誘引阻害因子の存在も示唆された。これらの結果から、脳血管内皮細胞がミクログリアの脳内移行性を促進する液性タンパク因子を分泌しており、一方、アストロサイトは血液脳関門を強化し、ミクログリアの侵入を阻害する因子を分泌していると考えられる。現在、尾繊維芽細胞由来核移植ntES細胞からの血管内皮細胞およびミクログリアの分化誘導を試みている。

1.桑德霍夫病小鼠小胶质细胞激活机制及脑迁移分析桑德霍夫病是一种伴有中枢神经系统损害的溶酶体疾病，是由构成β-己糖胺酶（Hex）的β链基因突变引起的。）是一种常染色体隐性遗传病，由大脑中GM2神经节苷脂（GM2）过度积累引起。为了在这种疾病模型小鼠（SD小鼠：Hexb-/-）中开发用于细胞治疗和离体基因治疗的供体细胞，我们分析了源自SD小鼠大脑的小胶质细胞系的特性和脑迁移能力。做过。 1）去年，我们发现SD小胶质细胞中GM2、GA2和末端含GlcNAc寡糖过度积累，巨噬细胞炎症因子1（MIP-1α）的产生和分泌增强。今年，我们发现磷脂酶C（PLC）、蛋白激酶C（PKC）和B（PKB或Akt）信号传导参与了这种增强，并且MIP-1α基因转录和蛋白的调控存在异常。分泌物首次显露出来。 2）我们创建了含有小鼠Hexb和绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组慢病毒，并将这些基因导入SD小胶质细胞中，当将所得的组成型表达菌株注射到野生型小鼠的尾静脉中时，一些结果显示这些细胞迁移到大脑中并侵入脑干区域的实质，保留了其作为脑迁移细胞的功能。 2.来自小鼠脑血管内皮细胞系的小胶质细胞吸引因子的分析为了阐明构成血脑屏障的脑血管内皮细胞和具有迁移到大脑的能力的小胶质细胞之间的相互作用，我们培养小鼠脑血管内皮细胞系，并对上清液中的小鼠小胶质细胞吸引因子进行分析。 1) 小鼠脑血管内皮细胞系（MBEC4）的培养上清液中含有一种体液因子，该因子不会影响单核细胞，但会促进小胶质细胞的浸润和迁移能力，并对胰蛋白酶表现出敏感性。当将培养物上清液应用于建立的小胶质细胞时，CDllb和肌动蛋白聚合的表达增加，诱导小胶质细胞活化并增加运动性。 2)当通过凝胶过滤分离MBEC4来源的培养上清液时，在500kDa以上的高分子区域和5kDa左右的低分子区域中检测到小胶质细胞吸引活性，表明其可能作为高分子存在建议培养上清液中的蛋白质复合物。 3)另一方面，当将构成血脑屏障的星形胶质细胞来源的培养上清液与MBEC4来源的培养上清液混合时，小胶质细胞吸引活性以剂量依赖性方式受到抑制，表明星形胶质细胞的存在-衍生的小胶质细胞吸引抑制剂就完成了。这些结果表明，脑血管内皮细胞分泌体液蛋白因子，促进小胶质细胞迁移到大脑中，而星形胶质细胞则分泌增强血脑屏障并抑制小胶质细胞侵袭的因子。我们目前正在尝试从尾部成纤维细胞来源的核移植ntES细胞中诱导血管内皮细胞和小胶质细胞的分化。