大腸菌の挿入因子IS1及びIS3の転移機構に関する研究

大肠杆菌插入因子IS1和IS3易位机制研究

基本信息

批准号：
05780497
负责人：
関根靖彦
金额：
$ 0.58万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05780497/
关键词：
挿入因子 IS1 IS3 トランスポゾントランスポゼ-ス転移

项目摘要

本研究は、大腸菌の代表的な挿入因子IS1とIS3に関して、その転移機構を解明する目的とした解析を行ない、以下のことが明らかになった。1.IS1の逆向き反復配列(IR)の解析:IS1のIRの機能の解析を進める為に、まずIS1の転移頻度を測定できるアッセイ系を構築した。即ち、IS1のIRを両端に持ちその間に薬剤耐性マーカーを挟んだ転移のユニット(ミニIS1)と、IPTGにより誘導可能なプロモーターにより発現が調節できるようにしたトランスポゼ-ス遺伝子とを持つプラスミドを作製し、このミニIS1が別の標的プラスミドへ転移する頻度をミニIS1に由来する薬剤耐性のコロニー数から測定するというものである。実際に、添加するIPTGに依存してIS1の転移がおこることが確かめられた。今後は、このアッセイ系を用いて、ミニIS1のIRに部位特異的変異を導入し、それがIS1の転移に与える効果を調べる予定である。2.IS3の転移機構の解析:(1)トランスポゼ-スが恒常的に産生されるような変異体IS3を持つプラスミドから生じる、転移中間体と考えられる直鎖状IS3分子を単離しその構造を詳細に解析した。その結果、直鎖状IS3分子は両末端にIS3の配列とは異なる5突出した3塩基の配列を有すること、その塩基配列はプラスミド上でIS3に隣接する配列と同じであることがわかった。このことは、直鎖状IS3分子がプラスミドから直接切り出されて生じたことを示し、この分子が転移の中間体である可能性を強く支持する。(2)IS3に関しても、1で述べたIS1の場合と同様のプラスミドを構築した。このプラスミドを保持する大腸菌において、IPTGの添加に依存して、ミニIS3による欠失反応やミニIS3の切り出し、環状化などの現象が観察された。(3)OrfA,OrfB蛋白質を誘導産生するプラスミドを構築した。このプラスミドを2-(2)で述べたプラスミドと共存させ、OrfA,OrfBの誘導がトランスポゼ-スにより誘起される現象に与える効果を現在調べている。(4)ファージT7のプロモーターを利用し、トランスポゼ-ス及びOrfA蛋白質の過剰生産に成功した。現在、各蛋白質の精製の他、in vivoでみられた現象が各蛋白質を含む粗抽出液の添加によりin vitroで再現できるかどうかを試みている。

这项研究进行了分析，目的是阐明IS1和IS3的转移机制，即大肠杆菌的代表性插入因子，并揭示了以下内容：1。对IS1的逆重复序列（IR）的分析：进行IS1的IR函数进行分析，首先构建了一个可以测量IS1转移频率的IS1的IR函数。换句话说，创建了一个质粒，该质粒在两端包含IS1的IR和转移单元（miniis1）夹在它们之间的药物抗性标记及其之间的抗药性标记，以及一个允许由IPTG诱导的启动子调节IPTG的启动子的转倍酶基因，以及该Miniis1转移到另一个质子质体的频率上，该质子均来自质子数的数量，该频率是降低的。实际上，已经确认IS1转移是根据添加的IPTG发生的。将来，我们将使用该测定系统将定向定向的突变引入Miniis1的IR，并研究其对IS1转移的影响。 2。对IS3的转移机理的分析：（1）被认为是转移中间体的线性IS3分子，这些分子是从携带突变体IS3的质粒得出的，其中构成了转座酶，分离了转座酶，并详细分析了它们的结构。结果，发现线性IS3分子在两端具有5个突出的3个碱基的序列，与IS3的序列不同，并且碱基序列与质粒上IS3的序列IS3相同。这表明线性IS3分子是通过直接从质粒中切除而产生的，强烈支持该分子是转移的中间体的可能性。（2）关于IS3，构建了类似于1中描述的IS1的质粒。在带有这种质粒的大肠杆菌中，观察到Miniis3的缺失反应，Miniis3的切除和圆形化的现象，具体取决于添加IPTG。（3）构建了诱导和产生ORFA和ORFB蛋白的质粒。该质粒与2-（2）中描述的质粒共存，目前正在研究ORFA和ORFB诱导ORFA和ORFB对转h的现象的影响。（4）使用噬菌体T7的启动子，转座酶和ORFA蛋白的过量生产成功。当前，除了纯化每种蛋白质外，我们还试图查看是否可以通过添加含有每种蛋白质的粗提取物在体外看到的现象。