大腸菌の挿入因子IS1及びIS3の転移機構に関する研究

大肠杆菌插入因子IS1和IS3易位机制研究

基本信息

批准号：
05780497
负责人：
関根靖彦
金额：
$ 0.58万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05780497/
关键词：
挿入因子 IS1 IS3 トランスポゾントランスポゼ-ス転移

项目摘要

本研究は、大腸菌の代表的な挿入因子IS1とIS3に関して、その転移機構を解明する目的とした解析を行ない、以下のことが明らかになった。1.IS1の逆向き反復配列(IR)の解析:IS1のIRの機能の解析を進める為に、まずIS1の転移頻度を測定できるアッセイ系を構築した。即ち、IS1のIRを両端に持ちその間に薬剤耐性マーカーを挟んだ転移のユニット(ミニIS1)と、IPTGにより誘導可能なプロモーターにより発現が調節できるようにしたトランスポゼ-ス遺伝子とを持つプラスミドを作製し、このミニIS1が別の標的プラスミドへ転移する頻度をミニIS1に由来する薬剤耐性のコロニー数から測定するというものである。実際に、添加するIPTGに依存してIS1の転移がおこることが確かめられた。今後は、このアッセイ系を用いて、ミニIS1のIRに部位特異的変異を導入し、それがIS1の転移に与える効果を調べる予定である。2.IS3の転移機構の解析:(1)トランスポゼ-スが恒常的に産生されるような変異体IS3を持つプラスミドから生じる、転移中間体と考えられる直鎖状IS3分子を単離しその構造を詳細に解析した。その結果、直鎖状IS3分子は両末端にIS3の配列とは異なる5突出した3塩基の配列を有すること、その塩基配列はプラスミド上でIS3に隣接する配列と同じであることがわかった。このことは、直鎖状IS3分子がプラスミドから直接切り出されて生じたことを示し、この分子が転移の中間体である可能性を強く支持する。(2)IS3に関しても、1で述べたIS1の場合と同様のプラスミドを構築した。このプラスミドを保持する大腸菌において、IPTGの添加に依存して、ミニIS3による欠失反応やミニIS3の切り出し、環状化などの現象が観察された。(3)OrfA,OrfB蛋白質を誘導産生するプラスミドを構築した。このプラスミドを2-(2)で述べたプラスミドと共存させ、OrfA,OrfBの誘導がトランスポゼ-スにより誘起される現象に与える効果を現在調べている。(4)ファージT7のプロモーターを利用し、トランスポゼ-ス及びOrfA蛋白質の過剰生産に成功した。現在、各蛋白質の精製の他、in vivoでみられた現象が各蛋白質を含む粗抽出液の添加によりin vitroで再現できるかどうかを試みている。

在本研究中，我们对大肠杆菌典型插入因子IS1和IS3的易位机制进行了分析，并得到了以下发现。 1.IS1的反向重复序列(IR)分析：为了分析IS1的IR的功能，我们首先构建了一个可以测量IS1转移频率的检测系统。也就是说，我们创建了一个质粒，该质粒具有两端带有 IS1 IR 的转座单元（mini IS1）和夹在其间的耐药标记，以及转座酶基因，其表达频率可以通过 IPTG 诱导型启动子来调节。根据来自mini-IS1的耐药菌落的数量来测量该mini-IS1转移到另一个目标质粒的数量。事实上，已证实IS1易位的发生取决于所添加的IPTG。未来，我们计划使用该检测系统在 mini-IS1 的 IR 中引入位点特异性突变，并研究其对 IS1 转移的影响。 2.IS3转座机制的分析： (1)我们分离了一个被认为是转座中间体的线性IS3分子，该分子是由含有不断产生转座酶的突变型IS3的质粒产生的，并确定了其结构。细节。结果发现，线性IS3分子具有与IS3序列不同的两端5个突出的3个碱基的序列，并且该碱基序列与质粒上与IS3相邻的序列相同。这表明线性IS3分子是通过从质粒中直接切除而产生的，并且强烈支持该分子是转移中间体的可能性。 (2)对于IS3，构建与1中描述的IS1相似的质粒。在携带该质粒的大肠杆菌中，根据IPTG的添加，观察到诸如mini-IS3的缺失反应、mini-IS3的切除和环化等现象。 (3)构建了用于诱导生产OrfA和OrfB蛋白的质粒。我们目前正在将该质粒与2-(2)中提到的质粒共存，并研究OrfA和OrfB的诱导对转座酶诱导现象的影响。 (4)利用噬菌体T7的启动子，我们成功地过量产生了转座酶和OrfA蛋白。除了纯化每种蛋白质之外，我们目前正在测试是否可以通过添加含有每种蛋白质的粗提物在体外重现体内观察到的现象。