大腸菌の挿入因子IS3の転移機構に関する研究

大肠杆菌插入因子IS3易位机制研究

基本信息

批准号：
07780591
负责人：
関根靖彦
金额：
$ 0.64万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07780591/
关键词：
トランスポゾン挿入因子トランスポゼ-ス転移反応

项目摘要

1. IS3トランスポゼ-ス過剰生産条件下で生じるDNA産物の構造解析及び、その生成機序の解明IS3のトランスポゼ-ス(Tnp)遺伝子を、アラビノースにより誘導可能なプロモーターの支配下においたプラスミドを構築した。このプラスミドを保持する大腸菌中で誘導条件下でのみ、環状及び直鎖状IS3分子が生じた。この結果は、このような特殊な構造を持つ分子がTnpの作用によって生じることを示し、これらの分子が転移反応の中間体であることを示唆する。このとき生じる直鎖状IS3分子の構造をプライマー伸長法等で解析した結果、この分子は5'端に3塩基の突出配列を有していた。また、Tnpを誘導産生すると、環状IS3分子が直鎖上IS3分子に変換されることを発見した。この結果は、IS3の転移反応が、(1)環状IS3分子の切り出し、(2)環状IS3分子から直鎖状IS3分子への変換、(3)直鎖状IS3分子の標的への組み込み、という経路で進行することを示唆する。2. IS3の転移頻度測定系の構築:クロラムフェニコール耐性遺伝子(Cm^r)を付与したIS3をもつプラスミドを作成した。このプラスミドと転移の標的プラスミドを共存させた大腸菌を一定時間培養した後、この菌体から調製したプラスミドDNAをエレクトロポーレーションで受容菌に導入した。Cm^rを示すコロニーが得られ、その個数から転移頻度は6x10^<-5>/cell divisionと算出された。3. IS3がコードするトランスポゼ-スの大量生産: T7プロモーターの下流にIS3のトランスポゼ-ス遺伝子をつなぎ、IPTG添加で誘導されるT7RNAポリメラーゼによる強い転写を利用してトランスポゼ-スを過剰に生産できるプラスミドを構築した。このプラスミドを用いてトランスポゼ-スの過剰生産を試みたが、期待していた生産はみられず、現在この点を改善すべく条件を検討しているところである。

1. IS3转座酶过量产生条件下产生的DNA产物的结构分析及其产生机制的阐明构建了将IS3转座酶(Tnp)基因置于阿拉伯糖诱导型启动子控制下的质粒。环状和线性 IS3 分子仅在含有该质粒的大肠杆菌中在诱导条件下产生。这一结果表明具有这种特殊结构的分子是通过Tnp的作用生成的，并表明这些分子是转移反应的中间体。使用引物延伸方法对此时产生的线性IS3分子的结构进行分析表明，该分子在其5'端具有三碱基突出序列。我们还发现 Tnp 的诱导产生将环状 IS3 分子转化为线性 IS3 分子。该结果表明IS3转移反应涉及(1)环状IS3分子的切除，(2)环状IS3分子向线性IS3分子的转化，以及(3)线性IS3分子并入靶标中。它沿着路线前进。 2、IS3易位频率测量系统的构建：构建含有带有氯霉素抗性基因(Cm^r)的IS3的质粒。将该质粒与转移目的质粒共存的大肠杆菌培养一定时间后，通过电穿孔将由细胞制备的质粒DNA导入到受体细菌中。获得显示Cm^r的集落，并根据6×10^-5/细胞分裂的数目计算转移频率。 3. IS3编码的转座酶的大量生产：通过将IS3转座酶基因连接到T7启动子下游，利用添加IPTG诱导的T7 RNA聚合酶的强转录，可以过量生产转座酶，构建质粒。我们尝试使用该质粒过量产生转座酶，但没有观察到预期的产量，我们目前正在研究改善这一点的条件。