大腸菌の挿入因子IS3の転移機構に関する研究

大肠杆菌插入因子IS3易位机制研究

基本信息

批准号：
07780591
负责人：
関根靖彦
金额：
$ 0.64万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07780591/
关键词：
トランスポゾン挿入因子トランスポゼ-ス転移反応

项目摘要

1. IS3トランスポゼ-ス過剰生産条件下で生じるDNA産物の構造解析及び、その生成機序の解明IS3のトランスポゼ-ス(Tnp)遺伝子を、アラビノースにより誘導可能なプロモーターの支配下においたプラスミドを構築した。このプラスミドを保持する大腸菌中で誘導条件下でのみ、環状及び直鎖状IS3分子が生じた。この結果は、このような特殊な構造を持つ分子がTnpの作用によって生じることを示し、これらの分子が転移反応の中間体であることを示唆する。このとき生じる直鎖状IS3分子の構造をプライマー伸長法等で解析した結果、この分子は5'端に3塩基の突出配列を有していた。また、Tnpを誘導産生すると、環状IS3分子が直鎖上IS3分子に変換されることを発見した。この結果は、IS3の転移反応が、(1)環状IS3分子の切り出し、(2)環状IS3分子から直鎖状IS3分子への変換、(3)直鎖状IS3分子の標的への組み込み、という経路で進行することを示唆する。2. IS3の転移頻度測定系の構築:クロラムフェニコール耐性遺伝子(Cm^r)を付与したIS3をもつプラスミドを作成した。このプラスミドと転移の標的プラスミドを共存させた大腸菌を一定時間培養した後、この菌体から調製したプラスミドDNAをエレクトロポーレーションで受容菌に導入した。Cm^rを示すコロニーが得られ、その個数から転移頻度は6x10^<-5>/cell divisionと算出された。3. IS3がコードするトランスポゼ-スの大量生産: T7プロモーターの下流にIS3のトランスポゼ-ス遺伝子をつなぎ、IPTG添加で誘導されるT7RNAポリメラーゼによる強い転写を利用してトランスポゼ-スを過剰に生産できるプラスミドを構築した。このプラスミドを用いてトランスポゼ-スの過剰生産を試みたが、期待していた生産はみられず、現在この点を改善すべく条件を検討しているところである。

1。在过量IS3转座酶产生条件下生产的DNA产物的结构分析以及生产机理的阐明。构建了质粒，其中IS3的转座酶（TNP）基因由可以通过阿拉伯糖诱导的启动子控制。只有在携带该质粒的大肠杆菌的诱导条件下，才会发生圆形和线性IS3分子。该结果表明，具有这种特殊结构的分子是由TNP的作用引起的，这表明这些分子是转移反应中的中间体。使用引物扩展方法等分析了此时生成的线性IS3分子的结构，并发现该分子在5'端具有三个碱基的突出序列。我们还发现，诱导的TNP产生将环状IS3分子转换为线性IS3分子。该结果表明，IS3转移反应通过以下途径进行：（1）切除环状IS3分子，（2）将环状IS3分子转换为线性IS3分子，以及（3）将线性IS3分子掺入到目标中。 2。构建用于测量IS3转移频率的系统：创建了载有质粒IS3的质粒，从而授予氯霉素抗性基因（CM^R）。在培养大肠杆菌后，该质粒和靶质粒在一定时间段内，通过电穿孔将从该细胞制备的质粒DNA引入受体细菌中。获得了显示CM^r的菌落，并计算出菌落的数量为6x10^<-5>/细胞分裂。 3。IS3编码的转座酶的质量产生：IS3的转座酶基因与T7启动子的下游相连，并且使用IPTG添加诱导的T7RNA聚合酶强的T7RNA聚合酶构建了能够过度生产转座酶的质粒。尽管我们试图使用这种质粒过度生产转座酶，但未预期观察到产生，我们目前正在考虑改善这一点的条件。