バクテリアの転移性遺伝因子ISの転移とその制御の分子機構

细菌转座遗传元件IS易位和调控的分子机制

基本信息

批准号：
13780546
负责人：
関根靖彦
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Rikkyo University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

1.IS3の8字型分子形成機構の解析:IS3の転移中間体である環状分子は特異な構造を持つ8字型分子から生じる。昨年度、確立した精製トランスポゼースを用いたin vitroの8字型分子形成反応系を用いて、この分子の生成機構を探るために、IS3の両端にある逆向き反復配列(IR)の色々な領域に変異を導入し、それを基質として8字型分子形成反応を調べた。その結果、IRには機能的に異なる組換えに必要な2つの領域(外側のA領域と内側のB領域)が存在し、左のIRからの組換えには左のIRのA領域と右のIRのB領域が必要であり、右のIRからの組換えにはそれと左右対称の領域が必要であることが分かった。この結果は2分子のトランスポゼースがそれぞれ一方のIRのA領域ともう一方のIRのB領域に結合し、IR間を架橋することを示唆する2.IS1の転移に関与する宿主因子H-NSの解析:H-NSの役割を解明するために、H-NSの欠損株でも転移能を有するトランスポゼースの変異体を取得した。また、H-NSの欠損株の染色体にランダムに挿入変異を誘起し、その変異株の中からIS1の転移が回復する株を数株取得した。3.IS3による融合体形成反応の解析:IS3は主たる転移産物として単純挿入体を生じるが、申請者はIS3を運ぶプラスミドと標的との融合体も形成することを発見した。融合体の多くは欠失を有する。この融合体の形成やそれに伴う欠失の機構を明らかにするために、融合体を数多く分離し、その構造をDNAシークエンシング等で解析したところ、欠失は完全な構造の融合体上の短い(4-9bp)相同配列間での組換えにより生じることが分かった。また、IS3の内部配列をほぼ完全に取り除いた変異体IS3は完全な構造の融合体を形成することが分かった。この結果は、IS3の内部配列が欠失の生成に関与していることを示す。

1. IS3 8 字形分子的形成机制分析：环状分子是 IS3 的过渡中间体，由结构独特的 8 字形分子生成。去年，我们使用我们建立的纯化转座酶的体外8字形分子形成反应系统来研究该分子的形成机制，我们引入了突变并研究了8字形分子形成反应。使用它作为基材。因此，IR 具有重组所需的两个功能不同的区域（外部 A 区域和内部 B 区域），并且从左侧 IR 进行重组需要左侧 IR 的 A 区域和右侧 IR 的 A 区域。需要正确的 IR，并且从正确的 IR 进行重组需要一个与其双边对称的区域。这一结果表明，两个转座酶分子结合一个IR的A区和另一个IR的B区，在IR之间建立了桥梁。 2. 分析：为了阐明H-NS的作用，我们获得了转座酶突变体：即使在 H-NS 缺陷菌株中也具有转移能力。此外，我们在H-NS缺陷菌株的染色体中随机诱导插入突变，并从突变菌株中获得了几个恢复IS1易位的菌株。 3.IS3的融合形成反应分析：IS3产生简单的插入片段作为主要转座产物，但申请人发现它也在携带IS3的质粒与靶标之间形成融合。许多融合都有缺失。为了阐明这种融合体的形成机制以及相关的缺失，我们分离了许多融合体，并通过DNA测序等分析了它们的结构，发现缺失发生在完整融合体的一小段长度（4-。 9bp)发现这是由于同源序列之间的重组而发生的。此外，还发现IS3的内部序列几乎被完全去除的突变体IS3形成了具有完整结构的融合体。该结果表明IS3的内部序列参与了缺失的产生。