大腸菌の全tRNA修飾酵素遺伝子の同定とtRNA修飾塩基の網羅的機能解析

鉴定所有大肠杆菌tRNA修饰酶基因并对tRNA修饰碱基进行全面功能分析

基本信息

批准号：
13206018
负责人：
関根靖彦
金额：
$ 3.39万
依托单位：
Rikkyo University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13206018/
关键词：
tRNA tRNA修飾酵素修飾塩基機能性RNA LC MS法

项目摘要

1 大腸菌の遺伝子破壊株を用いた大腸菌全tRNA修飾酵素遺伝子の同定(関根・鈴木)(1)RNA修飾酵素の網羅的探索のためには、多くの機能未知遺伝子(または機能既知遺伝子)の破壊株の培養、細胞からのRNA抽出とその解析を効率的に行う必要がある。そこで、ディープウェルプレートを用いた大腸菌の培養と96ウェルのタイタープレートを用いたRNA抽出により、1日あたり196サンプルのペースでサンプルが調製できるシステムを開発した。高速液体クロマトグラフィー質量分析装置(LC/MS)を用いた分析法もすでに検討を終了し、1日あたり19サンプルの自動分析が可能となった。これにより、1ヶ月の自動分析で約600サンプルを処理することができる体制が整った。(2)当初の計画では、大腸菌の各遺伝子の破壊株を1つ1つ解析する予定であったが、それに先立って、より効率良くtRNA修飾酵素遺伝子を探索するために、大腸菌ゲノムの広範囲ゲノム欠失変異株[加藤潤一博士(都立大)作製]及びYale大CGSCより取り寄せた広範囲ゲノム欠失変異株からRNAを抽出し、その分析を行った。その結果、13株で修飾の欠損が観測された。このうち3株については既知の修飾酵素遺伝子がゲノムの欠失領域に含まれることから、残りの10株は新規の修飾酵素遺伝子を欠失していることになる。欠損が観測された修飾塩基は、s2U, ac4C, Q, cmo5U, m7G, mnm5s2Uなどである。これら欠失領域中には10〜20個の遺伝子が含まれている。今後は、欠失領域中のどの遺伝子が修飾酵素遺伝子であるのかを決定していく予定である。なお、この広範囲ゲノム欠失変異株の解析により、既に大腸菌の1968個のORFについての探索を行ったことになる。

1 使用基因破坏的大肠杆菌菌株（Sekine 和 Suzuki）鉴定大肠杆菌中所有 tRNA 修饰酶基因 (1) 为了全面寻找 RNA 修饰酶，需要破坏许多未知的基因需要有效地培养菌株、从细胞中提取RNA并进行分析。因此，我们开发了一个系统，通过使用深孔板培养大肠杆菌并使用96孔滴定板提取RNA，每天可以制备196个样品。使用高效液相色谱质谱法 (LC/MS) 的分析方法的研究已经完成，可以每天自动分析 19 个样品。结果，建立了一个系统，可以在一个月的自动分析中处理大约 600 个样本。（2）原计划是对每一个基因被破坏的大肠杆菌菌株进行一一分析，但在此之前，为了更有效地寻找tRNA修饰酶基因，我们对大肠杆菌进行了全面的基因组分析。从缺失突变菌株[由Junichi Kato（东京都立大学）制备]和从耶鲁大学CGSC获得的广泛基因组缺失突变菌株中提取RNA并进行分析。结果，在13个菌株中观察到修饰缺陷。由于其中 3 个菌株在其基因组的缺失区域中已知有修饰酶基因，因此其余 10 个菌株缺乏新的修饰酶基因。观察到缺失的修饰碱基包括 s2U、ac4C、Q、cmo5U、m7G 和 mnm5s2U。这些删除的区域包含 10 到 20 个基因。将来，我们计划确定删除区域中的哪些基因正在修饰酶基因。通过分析这种广泛的基因组缺失突变株，我们已经搜索到了大肠杆菌的 1968 个 ORF。