バクテリアのtRNA修飾酵素遺伝子の網羅的同定とtRNA修飾塩基の機能解析

细菌tRNA修饰酶基因的全面鉴定及tRNA修饰碱基的功能分析

• 批准号: 14014249
• 负责人: 関根 靖彦
• 金额: $ 3.84万
• 依托单位: Rikkyo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14014249/
• 关键词: tRNA; tRNA修飾; 修飾塩基; 大腸菌; 枯草菌; LC; MS法; リシジン; イノシン

1.大腸菌の広範囲欠失変異株を用いたtRNA修飾酵素遺伝子の探索:効率良くtRNA修飾酵素遺伝子を探索するために、大腸菌の広範囲欠失変異株(加藤博士[都立大」及びYale大CGSCより分与)からRNAを抽出し、LC/MS法で分析した。昨年、同様の解析により8株において修飾の欠落を観測した。欠落が観測された修飾塩基は、s^2U, ac^4C, Q[2種], cmo^5U, m^7G, mum^5s^2U[2種]である。残りの広範囲ゲノム欠失変異株の解析を行ったところ、新たに3株について、それぞれm^6t^6A, Q, acp^3Uの欠落を観測した。2.大腸菌のtRNA修飾酵素遺伝子の同定:1で述べた欠失変異株では平均で約20の遺伝子を欠損している。このうちどれが原因遺伝子であるかを、個々の遺伝子の破壊株(三木博士[福岡歯科大]より分与)の分析と、各遺伝子を運ぶプラスミド(西村博士[遺伝研]より分与)を接合によって順番に欠失変異株に供給し、欠た修飾を復活させることで調べたところ、m^7G合成酵素遺伝子とmum^5s^2Uの2チオ化に関する酵素遺伝子を同定した(投稿準備中)。3.枯草菌の変異株を用いたtRNA修飾酵素遺伝子の探索と同定:(1)枯草菌の機能未知必須遺伝子の条件変異株(IPTGの添加により当該遺伝子発現が制御できる株;小笠原博士[奈良先端大]より分与)を-IPTG条件で培養した細胞からRNAを抽出し、分析した結果、L(リシジン)合成酵素遺伝子とcmum^5s^2Uの2チオ化に関する酵素遺伝子を同定した(Lについては投稿中)。(2)deaminaseモチーフを有する枯草菌の機能未知遺伝子の欠損株(小笠原博士より分与)数種の解析から、yaaJがtRNA^<Arg>のアンチコドンに存在するI(イノシン)の合成酵素遺伝子であることを示した。

1. Searching for tRNA-modifying enzyme genes using a wide-range deletion mutant of Escherichia coli: To efficiently search for tRNA-modifying enzyme genes, RNA was extracted from a wide-range deletion mutant of Escherichia coli (dispensed from Dr. Kato [Tokyo University] and Yale University CGSC) and analyzed by LC/MS method.去年，观察到类似的分析缺乏八种菌株的修饰。观察到缺失的修改底座是s^2u，ac^4c，q [2种]，cmo^5u，m^7g和妈妈^5S^2u [2种]。分析了其余广泛的基因组缺失突变体，三个新菌株分别显示缺乏M^6t^6a，Q和ACP^3U。 2。鉴定大肠杆菌中的tRNA修饰酶基因：1中提到的缺失突变体缺失了大约20个基因。通过分析单个基因破坏菌株（从Miki博士[福库卡牙科大学]）以及提供携带每个基因的质粒（从Nishimura [遗传学研究所]分配的质粒中，从而通过降低了7个基因的质量来启动congugation contem，并启用了模仿的质量，并通过分析单个基因（从Miki [Fukuoka Dental University]）进行了研究，从而研究了致病基因。鉴定了合成酶基因和妈妈^5S^2u（为发布准备）。 3. Searching and identification of tRNA-modifying enzyme genes using a mutant strain of Bacillus subtilis: (1) RNA was extracted from cells cultured under -IPTG conditions of a conditional mutant strain of Bacillus subtilis (a strain in which the gene expression can be controlled by the addition of IPTG; dispensed from Dr. Ogasawara [Nara Akai University]) under -IPTG conditions, and as a result, an鉴定了与L（licidin）合酶基因和CMUM^5S^2U的依次相关的酶基因（目前已发布L）。 （2）分析具有deaminease基序的枯草芽孢杆菌（由Ogasawara博士分配）的几种功能基因的分析表明，YAAJ是tRNA^<arg>的二（inosine）的合酶基因。