挿入因子IS1がコードするトランスポゼースの構造と機能に関する研究

插入因子IS1编码转座酶的结构与功能研究

• 批准号: 05J11501
• 负责人: 太田 信哉
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05J11501/
• 关键词: トランスポゾン; DNA組み換え; DNAタンパク質複合体; 構造解析; トランスポゼース; 組み換え; ホリデージャンクション

トランスポゾンの転移は、トランスポゼースが両IRに結合した後、トランスポゼースの2量体形成により、両IRが近接した形の安定な複合体であるトランスポソゾームを形成することによって起こると考えられている。このような複合体においてトランスポゼースは、IR特異的DNA結合活性に加え、転移中間体中の少なくとも4本のDNA鎖が交叉した、ホリデー様構造に特異的なDNA結合活性を持つことにより、安定な複合体であるトランスポソゾームを形成しているのではないかと考えた。そこで、IRを含まないホリデー構造をとるX字形の基質を作成し、これを用いてトランスポゼースが結合するかどうか調べた。その結果、トランスポゼースはX字型DNAに結合し、2つのトランスポゼース分子が結合した複合体を形成することを見出した。また、トランスポゼースはX字型のみならず、Y字型DNAにも結合すること、この場合には1つのトランスポゼース分子が結合した複合体を形成すること、さらに、IR配列を持たない2本鎖DNAには結合しないが、バルジ構造を持つ2本鎖DNAには結合することが分かった。これらの結果は、トランスポゼースが折れ曲がった2本のDNAを認識するという構造特異的DNA結合活性を保持していることを示唆する。このことは、トランスポゼースがIR特異的DNA結合活性に加え、構造特異的DNA結合活性を保持することにより、安定な複合体であるトランスポソゾームを形成するという上記の仮説を支持する。次に、トランスポゼースのどの領域が上記の活性に関わっているか、いくつかのトランスポゼース欠失変異体を用いてX字型あるいはY字型DNAへの結合を調べた。その結果、トランスポゼースのN及びC末領域が、両基質への結合に関わっていることが分かった。また、N末領域においてはジンクフィンガーモチーフ、および、ジンクフィンガーとヘリックスーターンーヘリックスモチーフの問に存在するヘリックス領域が、C末領域においてはDDEモチーフの存在する領域が、この活性に関わることが分かった。また、トランスポゼースの結合ドメインの構造を解析するために、トランスポゼースのN末端領域とタンパク質Gの一部を融合したタンパク質を発現、生成した。これをサンプルとし、NMRを用いた構造解析を試みた。その結果、このタンパク質の一部のアミノ酸をNMRで認識することに成功した。

当转座酶与IRS结合，然后将转座酶的二聚体的形成形成转座体形成转座体时，转座子转移会发生。在这样的络合物中，不仅通过IR特异性的DNA结合活性，而且通过具有特定于假日样结构的DNA结合活性，转座酶形成了稳定的复合体转座体，其中转移中间交叉中至少四个DNA链。因此，创建了一个X形的底物，该基材具有不包含IR的节日结构，并用它来确定转座酶是否结合。结果，我们发现转座酶与X形DNA结合并在两个转座酶分子之间形成结合物。还发现转座酶不仅与X形结合，而且与Y形DNA结合，在这种情况下，它形成了一个复合酶，其中一个转座酶分子结合了，并且它不与没有IR序列的双链DNA结合，但确实与具有IR序列的双链DNA结合，但确实与双链DNA结合到双链DNA，该DNA与双链DNA结合。这些结果表明，转座酶保留了结构特异性的DNA结合活性，该活性识别两个弯曲的DNA。这支持了上述假设，即转座酶除了IR特异性的DNA结合活性外保留了结构特异性的DNA结合活性，从而形成了稳定的复合物，转座体。接下来，使用几个转座酶缺失突变体检查了上述活性的转座酶区域与X形或Y形DNA的结合。结果表明，转座酶的N和C末端区域与两个底物的结合有关。还发现，在锌指和螺旋旋转螺旋基序中存在的N末端区域和螺旋区域的锌指基序，以及在该活动中涉及DDE基序的C-末端区域的区域。另外，为了分析转座酶的结合结构域的结构，通过融合转座酶的N末端区域和蛋白质G的一部分来表达蛋白质和产生。我们使用该样品，我们尝试使用NMR进行结构分析。结果，我们通过NMR成功识别了该蛋白的一些氨基酸。