挿入因子IS1がコードするトランスポゼースの構造と機能に関する研究

插入因子IS1编码转座酶的结构与功能研究

• 批准号: 05J11501
• 负责人: 太田 信哉
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05J11501/
• 关键词: トランスポゾン; DNA組み換え; DNAタンパク質複合体; 構造解析; トランスポゼース; 組み換え; ホリデージャンクション

トランスポゾンの転移は、トランスポゼースが両IRに結合した後、トランスポゼースの2量体形成により、両IRが近接した形の安定な複合体であるトランスポソゾームを形成することによって起こると考えられている。このような複合体においてトランスポゼースは、IR特異的DNA結合活性に加え、転移中間体中の少なくとも4本のDNA鎖が交叉した、ホリデー様構造に特異的なDNA結合活性を持つことにより、安定な複合体であるトランスポソゾームを形成しているのではないかと考えた。そこで、IRを含まないホリデー構造をとるX字形の基質を作成し、これを用いてトランスポゼースが結合するかどうか調べた。その結果、トランスポゼースはX字型DNAに結合し、2つのトランスポゼース分子が結合した複合体を形成することを見出した。また、トランスポゼースはX字型のみならず、Y字型DNAにも結合すること、この場合には1つのトランスポゼース分子が結合した複合体を形成すること、さらに、IR配列を持たない2本鎖DNAには結合しないが、バルジ構造を持つ2本鎖DNAには結合することが分かった。これらの結果は、トランスポゼースが折れ曲がった2本のDNAを認識するという構造特異的DNA結合活性を保持していることを示唆する。このことは、トランスポゼースがIR特異的DNA結合活性に加え、構造特異的DNA結合活性を保持することにより、安定な複合体であるトランスポソゾームを形成するという上記の仮説を支持する。次に、トランスポゼースのどの領域が上記の活性に関わっているか、いくつかのトランスポゼース欠失変異体を用いてX字型あるいはY字型DNAへの結合を調べた。その結果、トランスポゼースのN及びC末領域が、両基質への結合に関わっていることが分かった。また、N末領域においてはジンクフィンガーモチーフ、および、ジンクフィンガーとヘリックスーターンーヘリックスモチーフの問に存在するヘリックス領域が、C末領域においてはDDEモチーフの存在する領域が、この活性に関わることが分かった。また、トランスポゼースの結合ドメインの構造を解析するために、トランスポゼースのN末端領域とタンパク質Gの一部を融合したタンパク質を発現、生成した。これをサンプルとし、NMRを用いた構造解析を試みた。その結果、このタンパク質の一部のアミノ酸をNMRで認識することに成功した。

转座子转座被认为是通过转座酶与两个 IR 结合，然后转座酶二聚化形成转座体（一种稳定的复合物，其中两个 IR 非常接近）而发生的。在这样的复合物中，转座酶除了具有IR特异性DNA结合活性外，还具有霍利迪样结构特异性的DNA结合活性，其中转座中间体中至少有4条DNA链交叉。它们可能形成转座体，这是一个复合体。因此，我们制作了不含IR的具有Holliday结构的X形底物，并用它来检查转座酶是否会结合。结果，他们发现转座酶与X形DNA结合，形成由两个转座酶分子组成的复合物。此外，转座酶不仅与X形DNA结合，还与Y形DNA结合，在这种情况下，单个转座酶分子形成结合复合物，但发现它与具有凸起的双链DNA结合。结构。这些结果表明转座酶保留了识别两条弯曲 DNA 链的结构特异性 DNA 结合活性。这支持了上述假设，即转座酶通过保留结构特异性 DNA 结合活性以及 IR 特异性 DNA 结合活性来形成稳定的复合物，即转座体。接下来，为了确定转座酶的哪个区域参与上述活性，我们使用几种转座酶缺失突变体研究了与 X 形或 Y 形 DNA 的结合。结果表明，转座酶的 N 端和 C 端区域参与与两种底物的结合。此外，还发现N端区域中的锌指基序和锌指与螺旋-转角-螺旋基序之间的螺旋区域，以及C端区域中包含DDE基序的区域，参与了这个活动。另外，为了分析转座酶的结合结构域的结构，我们表达并产生了转座酶的N末端区域与G蛋白的一部分融合的蛋白质。以此为样本，我们尝试使用 NMR 进行结构分析。结果，他们利用核磁共振成功识别了这种蛋白质的一些氨基酸。