化学発光基質を用いたin situ hybridization高感度検出系の開発

开发使用化学发光底物的高灵敏度原位杂交检测系统

• 批准号: 05770145
• 负责人: 鈴木 幸一
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: 山梨医科大学
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05770145/
• 关键词: 化学発光; in situ hybridization

In situハイブリダイゼーションの検出系には、ブローブに放射性同位元素を標識しオートラジオグラフィーで検出する方法や、プローブに何らかの分子を導入しそれを抗体等で検出して最終的に酵素基質反応で可視化する方法などが採られている。今回試みた化学発行基質はフィルターハイブリダイゼーションにおいて最近用いられるようになり、放射性同位元素を使わないという利点があるとともに高感度である。化学発行基質の組織学的検出系への応用という観点から考えると、既に広く用いられている酵素抗体法においても同様に応用され得るはずである。この点に着目して、まず酵素抗体法で予備検討を行った。対象として手術材料から得られたヒト扁桃を用い、ホルマリン固定、パラフィン包理切片を作製し、細胞増殖マーカーであるPCNAまたはMIB-1の1次抗体希釈系列を反応、2次抗体にペルオキシダーゼまたはアルカリフォスファターゼ標識抗体を用い、基質として前者にはECL検出試薬(Amersham)を後者にはスマイライトルミステイン(住友金属)を反応させた。化学発光の検出にはArgus-50/VIM3(浜松ホトニクス)を用いた。通常の光学顕微鏡レベルの酵素抗体法では1次抗体至適希釈倍率は500倍であったが、化学発光基質をではいづれの基質を用いた場合でも5000倍から10000倍が適当であり、それより濃いと非特異的発光が強く見られた。すなわち常法より10倍から20倍の検出感度が得られた。次に、ヒト子宮頚部組織を用いパピローマウイルスDNAに対するプローブを用いたin situハイブリダイゼーションで検討を行い、本法が検出系として応用可能であることを確認した。すなわち、化学発行基質の組織学への応用により、放射性同位元素を用いない高感度検出系を確立可能であることが示された。今後、検出に用いる装置の簡略化および分解能の向上がより進めば、組織学の分野でも広く用いられる可能性のある方法と考えられる。

原位杂交检测系统包括用放射性同位素标记探针并通过放射自显影技术进行检测的方法，或者将某种分子引入探针中，用抗体等进行检测，最后通过放射自显影技术进行可视化的方法。正在采用酶-底物反应的方法。我们这次尝试的化学释放底物最近已用于过滤杂交，其优点是不使用放射性同位素，灵敏度高。考虑到化学释放底物在组织学检测系统中的应用，应该可以将该方法类似地应用于已经广泛使用的酶抗体方法。针对这一点，我们首先利用酶抗体法进行了初步研究。使用从手术材料获得的人扁桃体作为受试者，制备福尔马林固定和石蜡包埋的切片，并使细胞与PCNA或MIB-1（细胞增殖标记物）的一抗稀释系列和过氧化物酶或过氧化物酶反应。使用磷酸酶标记抗体作为二抗，前者与ECL检测试剂(Amersham)反应，后者与Smiley Lumistein(Sumitomo Metals)反应。 Argus-50/VIM3 (Hamamatsu Photonics) 用于检测化学发光。使用普通光学显微镜的酶联免疫吸附法中一抗的最佳稀释倍数为500x，但对于化学发光底物，合适的稀释倍数为5000x至10000x，无论使用哪种底物，当其呈暗色时，强非。 -观察到特异性发光。换句话说，检测灵敏度比传统方法高10至20倍。接下来，我们使用人宫颈组织与乳头瘤病毒DNA探针进行原位杂交，并证实该方法可以用作检测系统。换句话说，结果表明，通过将化学释放的底物应用于组织学，可以建立不使用放射性同位素的高灵敏度检测系统。未来，如果检测所用的设备得到简化，分辨率进一步提高，该方法被认为有可能在组织学领域得到广泛应用。