色素性乾皮症の修復欠損に関する遺伝子とタンパク質の異常

与着色性干皮病修复缺陷相关的基因和蛋白质异常

基本信息

批准号：
04151041
负责人：
藤原美定
金额：
$ 8.96万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Cancer Research
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は班組織として色素性乾皮症(XP)のDNA修復欠損とタンパンの異常、XPACタンパクと複合体を形成する因子、XPCとXPDの欠損を相補する遺伝子、修復に関連する遺伝子とタンパク等について研究している。数種のXPC細胞にのみ共通する74kDのDNA依存性ATPase Q1のDNAヘリカーゼ活性の著減とモノQカラム溶出位置の変化が見られた。この精製正常酵素のアミノ酸配列のオリゴヌクレオチドをプローブとしてクローニングしたATPase Q1 cDNAはヘリカーゼドメインをもち、ヒト染色体12p12にあり、4.3kb mRNAをコードする。ヒトcDNAを用いた発現クローニング実験によって、XPD細胞のUV高感受性と修復欠損を3倍回復させる形質転換株が得られ、このcDNAは約2.5kbであった。XPAを相補するXPAC cDNAから合成したXPACタンパクは、Zn-fingerを介してUV損傷DNAにより強く結合し、そのドメインのCys-108を人工変異させるとDNA結合性と修復活性を失う。また、XPACタンパクはPCNA,DNA polymerase-δ,RF-Cを含む少なくとも5つのタンパクと複合体を作り、初期修復段階や修復合成に関与する。修復酵素に関し、塩基欠失部位を修復するAPEX nucleaseのヒトcDNAがクローニングされ、1.5kb mRNAと318アミノ酸からなる35.4kDタンパクとして脳などの組織で発現する。一方、UV損傷のピリミジン2量体、(6-4)光産物とその光異性体のDewar異性体に対する特異的単クローン抗体が樹立できた。これを用いると、XPA,XPDでは2量体と(6-4)産物の修復欠損が目立ち、XPAC cDNA導入細胞では両損傷を正常に修復することが明かになった。UVの発癌性突然変異をPCR-SSCP法と直接シーケンシングによってXP患者の皮膚腫瘍を用いて解析すると、癌抑制遺伝子のp53のエクソン4,5,6のTCとCC配列においてC→Tへの突然変異(G:C→A:T)が皮膚腫瘍の63%の高い頻度で見られ、p53変異が重要であった。

本研究的重点是着色性干皮病（XP）中的DNA修复缺陷和蛋白质异常、与XPAC蛋白质形成复合物的因子、补充XPC和XPD缺陷的基因以及与修复相关的基因和蛋白质。 74kD DNA 依赖性 ATPase Q1（仅在几种类型的 XPC 细胞中常见）的 DNA 解旋酶活性显着降低，并且观察到 MonoQ 柱的洗脱位置发生变化。使用该纯化的正常酶的氨基酸序列的寡核苷酸作为探针克隆的ATP酶Q1 cDNA具有解旋酶结构域，位于人染色体12p12上，并编码4.3kb的mRNA。使用人cDNA的表达克隆实验产生了一种转化体，该转化体使XPD细胞的紫外线敏感性和修复缺陷恢复了三倍，并且该cDNA约为2.5 kb。由 XPAC cDNA 合成的 XPAC 蛋白与 XPA 互补，通过锌指与紫外线损伤的 DNA 结合更牢固，当该结构域中的 Cys-108 被人为突变时，它会失去 DNA 结合和修复活性。此外，XPAC蛋白与至少五种蛋白形成复合物，包括PCNA、DNA聚合酶-δ和RF-C，并参与早期修复步骤和修复合成。关于修复酶，修复碱基缺失位点的 APEX 核酸酶的人类 cDNA 已被克隆，并在大脑等组织中表达为由 1.5kb mRNA 和 318 个氨基酸组成的 35.4kD 蛋白质。另一方面，我们能够建立针对紫外线损伤的嘧啶二聚体、(6-4)光产物及其光异构体的杜瓦异构体的特异性单克隆抗体。利用这一点，发现在XPA和XPD中，二聚体和(6-4)产物的修复缺陷是明显的，而引入XPAC cDNA的细胞可以正常修复这两种损伤。使用 PCR-SSCP 和直接测序对 XP 患者的皮肤肿瘤进行的 UV 致癌突变分析表明，肿瘤抑制基因 p53 的外显子 4、5 和 6 的 TC 和 CC 序列存在 C→T 转变。 G:C→A:T）在皮肤肿瘤中的出现频率高达 63%，p53 突变很重要。