高発癌性遺伝病色素性乾皮症A群に欠損する遺伝子と形質転換

高致癌性遗传病着色性干皮病A组的基因及转化缺陷

基本信息

批准号：
61015063
负责人：
藤原美定
金额：
$ 1.66万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Cancer Research
财政年份：
1986
资助国家：
日本
起止时间：
1986 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-61015063/
关键词：
色素性乾皮症 UV抵抗性形質転換 DNA導入 cDNA A群遺伝子 DNA修復除去修復

项目摘要

高発癌性色素性乾皮症(XP)には9遺伝子相補群があり、共通して除去修復初期段階活性を欠損する。日本で発症頻度と発癌性の最も高いA群遺伝子をクローニングすることが重要である。ゲノムDNA導入は成功しないので、本研究では哺乳類発現ベクター上のcDNAを導入し、A群細胞のUV抵抗性(【UV^r】)形質転換をおこすcDNAのクローニングを目的とした。1.cDNAライブラリーpcDHFの作成。ヒト正常線維茅細胞(HF)からpdy【A^+】mRNAをオリゴdTカラムで調整し、岡山・バーグ法でSV40プロモーターをもつ哺乳類発現ベクターpcDに組換え、全cDNAのpcDHFライブラリーを作成した。2.A群XP細胞へのpcDHF DNAの導入と【UV^r】形質転換クローンの分離。SV40永久株A群XP20S(SV)にpcDAF DNAを共沈法で導入し、発現期間をおいて2〜3回UV選択をし【UV^r】クローンを分離した。5×【10^8】非導入細胞から【UV^r】復帰変異はなく、【10^9】細胞(数回導入実験)から約100一次生存コロニーを得た。一過性発現と不安定クローンを再度除き、安定な【UV^r】転換クローン4株を得た。生存曲線・UDS解析から、いづれも部分転換形質を示し、その中XP20S(SV)pcD23は最も高い。親株の4倍の【UV^r】形質を示し、そのゲノムDNAは1コピーpcDの組込みを有し、二次導入で【UV^r】形質転換能を示した。3.A群細胞に【UV^r】形質を与えるcDNA遺伝子のクローニング。pcD23ゲノムDNAの20kb断片のλEMBL4ライブラリーから、pcDベクター・プローブによって8陽性クローンを得た。その中λ3とλ9が親XP2OS細胞を【UV^r】に形質転換した。λ3の制限酵素地図を作成し、かつインサート断片をプローブとして、もやのpcDHFライブラリーより1個の特異的cDNA遺伝子を拾った。現在、塩茎配列の決定を行っている。A群遺伝子産物の同定とA群染色体遺伝子の探索,染色体局在,産物の作用機構などの研究が将来展望できる。

高度致癌性心排骨色素（XP）具有9个基因互补基，并且通常缺乏切除修复的早期活性。克隆A组基因很重要，该基因的发作频率和致癌性最高。由于基因组DNA的引入未成功，因此这项研究旨在引入cDNA，以引入哺乳动物表达载体和cDNA的克隆，从而导致抗UV抗性（[UV^r]）A组细胞的转化。 1。创建cDNA库pcdhf。使用寡素柱从人正常纤维髓样细胞（HF）中制备PDY [A^+] mRNA，并使用okeama-berg方法与SV40启动子一起重新组合使用哺乳动物表达载体PCD，以创建所有cDNA的PCDHF库。 2。将PCDHF DNA引入A组XP细胞和[UV^r]转换克隆的分离。将PCDAF DNA引入了SV40永久性菌株的A组XP20（SV），并在表达期间进行了2-3次选择紫外线，并分离了[UV^r]克隆。没有从5个[10^8]未引入细胞的UV^r逆转，并且从10^9个细胞中获得了大约100个初级存活菌落（几次引入实验）。重新排除了瞬态表达和不稳定的克隆，并获得了四个稳定的[UV^r]转化的克隆。生存曲线和UDS分析表明，两者都显示出部分转化的性状，其中XP20（SV）PCD23是最高的。它显示出[uv^r]性状的四倍，其基因组DNA具有一个副本的PCD副本，并证明了在继发引入时转化[uv^r]的能力。 3.克隆cDNA基因，该基因给出了[uv^r]特征将A分组的。通过PCD载体探针从20 kb的PCD23基因组DNA的λembl4库中获得8个阳性克隆。其中，λ3和λ9将父XP2OS细胞转化为[uv^r]。创建了λ3的限制酶图，并使用插入片段作为探针从Haya PCDHF文库中收集一个特定的cDNA基因。目前，正在确定盐茎序列。将来可以研究A组基因产物和搜索A组染色体基因，染色体定位以及该产品的作用机理的识别。