高発癌性遺伝病色素性乾皮症A群に欠損する遺伝子と形質転換

高致癌性遗传病着色性干皮病A组的基因及转化缺陷

基本信息

批准号：
61015063
负责人：
藤原美定
金额：
$ 1.66万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Cancer Research
财政年份：
1986
资助国家：
日本
起止时间：
1986 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-61015063/
关键词：
色素性乾皮症 UV抵抗性形質転換 DNA導入 cDNA A群遺伝子 DNA修復除去修復

项目摘要

高発癌性色素性乾皮症(XP)には9遺伝子相補群があり、共通して除去修復初期段階活性を欠損する。日本で発症頻度と発癌性の最も高いA群遺伝子をクローニングすることが重要である。ゲノムDNA導入は成功しないので、本研究では哺乳類発現ベクター上のcDNAを導入し、A群細胞のUV抵抗性(【UV^r】)形質転換をおこすcDNAのクローニングを目的とした。1.cDNAライブラリーpcDHFの作成。ヒト正常線維茅細胞(HF)からpdy【A^+】mRNAをオリゴdTカラムで調整し、岡山・バーグ法でSV40プロモーターをもつ哺乳類発現ベクターpcDに組換え、全cDNAのpcDHFライブラリーを作成した。2.A群XP細胞へのpcDHF DNAの導入と【UV^r】形質転換クローンの分離。SV40永久株A群XP20S(SV)にpcDAF DNAを共沈法で導入し、発現期間をおいて2〜3回UV選択をし【UV^r】クローンを分離した。5×【10^8】非導入細胞から【UV^r】復帰変異はなく、【10^9】細胞(数回導入実験)から約100一次生存コロニーを得た。一過性発現と不安定クローンを再度除き、安定な【UV^r】転換クローン4株を得た。生存曲線・UDS解析から、いづれも部分転換形質を示し、その中XP20S(SV)pcD23は最も高い。親株の4倍の【UV^r】形質を示し、そのゲノムDNAは1コピーpcDの組込みを有し、二次導入で【UV^r】形質転換能を示した。3.A群細胞に【UV^r】形質を与えるcDNA遺伝子のクローニング。pcD23ゲノムDNAの20kb断片のλEMBL4ライブラリーから、pcDベクター・プローブによって8陽性クローンを得た。その中λ3とλ9が親XP2OS細胞を【UV^r】に形質転換した。λ3の制限酵素地図を作成し、かつインサート断片をプローブとして、もやのpcDHFライブラリーより1個の特異的cDNA遺伝子を拾った。現在、塩茎配列の決定を行っている。A群遺伝子産物の同定とA群染色体遺伝子の探索,染色体局在,産物の作用機構などの研究が将来展望できる。

高致癌性着色性干皮病（XP）具有九个基因互补组，通常缺乏切除修复的早期活性。克隆日本发病率和致癌性最高的A组基因非常重要。由于基因组 DNA 导入尚未成功，在本研究中，我们旨在通过在哺乳动物表达载体上导入 cDNA 来克隆诱导 A 组细胞抗紫外线 ([UV^r]) 转化的 cDNA。 1. cDNA文库pcDHF的创建。使用oligo-dT柱从人正常成纤维细胞（HF）制备pdy[A^+] mRNA，并使用Okayama-Berg方法与具有SV40启动子的哺乳动物表达载体pcD重组以创建总cDNA的pcDHF文库. 2.将pcDHF DNA引入A组XP细胞并分离[UV^r]转化的克隆。通过共沉淀法将pcDAF DNA导入SV40永久株A组XP20S(SV)中，表达期后进行2～3次UV选择，分离[UV^r]克隆。 5×[10^8]个未转染细胞未出现[UV^r]回复突变，[10^9]个细胞获得约100个原代活菌落（多次转染实验）。再次去除瞬时表达和不稳定的克隆，获得4个稳定的[UV^r]转化克隆。生存曲线和UDS分析显示均出现部分转化,其中XP20S(SV)pcD23转化最高。它显示出四倍于亲本菌株的[UV^r]性状，其基因组DNA具有1个pcD整合拷贝，并且在二次引入时显示出[UV^r]转化能力。 3.克隆赋予A组细胞[UV^r]特性的cDNA基因。使用pcD载体探针从pcD23基因组DNA的20kb片段的λEMBL4文库中获得8个阳性克隆。其中，λ3和λ9将亲代XP2OS细胞转化为[UV^r]。创建了 λ3 的限制酶图谱，并使用插入片段作为探针从 Moya 的 pcDHF 文库中挑选出一个特定的 cDNA 基因。目前，盐茎的序列正在确定。未来的前景包括A组基因产物的鉴定、A组染色体基因的寻找、染色体定位以及产物作用机制的研究。