染色体GC含量を制御するミューテーター遺伝子(mutT)の分子遺伝学的研究

控制染色体GC含量的突变基因（mutT）的分子遗传学研究

基本信息

批准号：
63618510
负责人：
堀内嵩
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1988
资助国家：
日本
起止时间：
1988 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

生物界に存在するゲノムDNAのGC含量は、広い範囲(25%〜75%)に分布している。しかし進化の過程における、この大きなGC含量の変動の要因については現在でも未知のままである。我々はこの要因の一つとして考えられる大腸菌ミューテーター(mutT)遺伝子の解析を進めてきた。というのは、このミューテーターは、A:T→C:Gへの一方向のトランスバージョン型変異のみを上昇させるからである。実際、mutTミューテーターの長時間培養により、染色体のGC含量が増加することが確かめられている。我々は、このMutTタンパク質の酵素活性を同定することから、A:T→C:Gへの特異的なトランスバージョン変異生成の分子レベルでの機構を知ることができると考えた。そのため、mutT遺伝子をクローニングし、その遺伝子構造を明らかにするとともに、MutTタンパク質を過剰生産し、精製を行い、その酵素試料を用いて以下の生化学的解析を行った。上記トランスバージョン変異生成の中間体としては、dA:dGミスマッチ塩基対が予想される。実際、立体異性体のanti型dAMPとsyn型dGMPは、ワトソン-クリック型塩基対合を形成しうるとするモデルが提出されている。このミスマッチをDNAポリメラーゼIII酵素が形成しうるか否かを調べた。テンプレートにpoly(dA)、プライマーにpoly(dT)、基質としてdGTPのみを用いると、低頻度ながらdGMPの取り込みが認められた。驚いたことに、この取り込みが、精製したMutTタンパク質の添加によって完全に抑制された。さらにMutTタンパク質が、dGTPase活性を有することも見出した。現在、MutTタンパク質が、dGTPの立体構造(anti型とsyn型)を認識し、syn型を特異的に分解していると考えており、今後その検証を行いたい。

生物体内存在的基因组DNA的GC含量分布范围很广(25%～75%)。然而，进化过程中GC含量发生如此大变化的原因仍不清楚。我们一直在分析大肠杆菌突变（mutT）基因，这被认为是造成这种情况的因素之一。这是因为该突变子仅增加从 A:T 到 C:G 的单向颠换突变。事实上，已经证实，长期培养mutT突变体会增加染色体的GC含量。我们认为，通过鉴定该 MutT 蛋白的酶活性，我们将能够在分子水平上了解特定 A:T→C:G 颠换突变产生的机制。因此，我们克隆了mutT基因，阐明了其遗传结构，过量产生了MutT蛋白，对其进行了纯化，并使用所得酶样品进行了以下生化分析。 dA:dG 错配碱基对预计是上述颠换诱变中的中间体。事实上，已经提出了一种模型，其中立体异构体抗 dAMP 和顺 dGMP 可以形成 Watson-Crick 碱基配对。我们研究了 DNA 聚合酶 III 酶是否可以形成这种错配。当仅使用poly(dA)作为模板、使用poly(dT)作为引物、使用dGTP作为底物时，观察到dGMP掺入，尽管频率较低。令人惊讶的是，添加纯化的 MutT 蛋白完全抑制了这种摄取。此外，我们发现MutT蛋白具有dGTPase活性。我们目前认为MutT蛋白识别dGTP的三维结构（反型和顺型）并特异性降解顺型，我们希望在未来验证这一点。