SOS応答におけるシグナル分子産生の分子機構

SOS反应中信号分子产生的分子机制

基本信息

批准号：
07253229
负责人：
堀内嵩
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Okazaki National Research Institutes
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07253229/
关键词：
大腸菌ストレス応答複製フォーク阻害点 SOS誘導

项目摘要

大腸菌のSOS応答はストレス応答の代表例では有るものの、その始動のステップの分子機構は充分解っていない。その一つの原因は系の複雑さにある。我々は系の単純化のため、染色体上の複製フォーク阻害点(Ter)を利用した。このフォーク阻害活性は、Ter-Ter結合(Tus)タンパク質との複合体形成により発現される。これまでの研究からこのTer-Tus複合体によるフォーク阻害の結果、SOS誘導が起こることを明らかにしている。本年度は蛋白工学研の鎌田・森川両氏との共同研究により、このTerとTer複合体の結晶化に成功し、その立体構造を明らかにしつつある。今後他のDNA結合タンパク質との構造比較により、Tus特異的なフォーク阻害の機構を明らかにする一方フォーク阻害を起こさない一般のDNA結合タンパク質の構造的共通性の有無をも明らかにできると考えている。一方Ter部位でのフォーク阻害によって誘導されるSOS反応のうち、特に初期反応を明らかにするためには、大腸菌染色体よりもプラスミドを用いる方が優れている。そのためプラスミドに合成したTer配列を挿入し、フォーク阻害が起こるプラスミドを作製した。またこれとは別に、Tusタンパク質の発現をON-OFFにする目的でアラビノースプロモーター下にtus遺伝子を挿入した発現プラスミドを作製した。この2種のプラスミドを、tus^-株へ導入し、アラビノース添加によりTusタンパク質が誘導され、その結果プラスミドの複製がTer部位で阻害され、SOSが誘導される系を作った。現在この系を用いて、フォーク阻害とSOS誘導の関係を調べているが、これまでにプラスミドの複製開始点(ori)からTerまでの距離とSOS誘導のレベルに相関があるという予備的結果を得ている。この系を用いてSOS誘導の基本的な初期反応を本年度中に明らかにしたい。

尽管大肠杆菌的SOS反应是应激反应的典型例子，但其起始步骤的分子机制尚未完全阐明。原因之一是系统的复杂性。我们使用染色体上的复制叉抑制点（Ter）来简化系统。这种分叉抑制活性通过与 Ter-Ter 结合 (Tus) 蛋白形成复合物来表达。先前的研究表明，SOS 诱导是 Ter-Tus 复合体抑制分叉的结果。今年，通过与蛋白质科学研究所蒲田教授和森川教授的联合研究，我们成功结晶了这种Ter-Ter复合物，目前正在阐明其三维结构。未来，我们相信，通过与其他DNA结合蛋白的结构比较，我们将能够阐明Tus特异性叉子抑制的机制，同时也阐明一般DNA结合蛋白之间是否存在结构相似性。不会造成分叉抑制。另一方面，使用质粒比大肠杆菌染色体更好地阐明Ter位点分叉抑制诱导的SOS反应，尤其是初始反应。因此，我们将合成的Ter序列插入质粒中以创建抑制分叉的质粒。单独地，创建表达质粒，其中将tus基因插入到阿拉伯糖启动子下，以打开和关闭Tus蛋白的表达。将这两个质粒导入tus β- 菌株中，建立了通过添加阿拉伯糖诱导Tus蛋白的系统，结果，在Ter位点抑制质粒复制并诱导SOS。我们目前正在利用这个系统来研究fork抑制和SOS诱导之间的关系，目前我们已经得到了初步结果，即质粒复制起点（ori）到Ter的距离与SOS诱导水平之间存在相关性。我明白了。我们想利用这个系统来澄清今年内SOS感应的基本初步反应。