複製終結点付近に見られる高頻度相同的組換え機構

在复制终止点附近观察到的高频同源重组机制

基本信息

批准号：
04262211
负责人：
堀内嵩
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Okazaki National Research Institutes
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至 1992
项目状态：
已结题

项目摘要

相同的組換え機構の解明には、その頻度が上昇した組換えのホットスポットの解析が有効と思われる。このことは、自然突然変異の機構解明にミューテーターの果たした役割を考えれば明かであろう。我々は大腸菌のRNaseH欠損変異株において、特に顕著に上昇するホットスポットを見いだし、解析を進めきた。具体的には、計8ケ所のホットスポット(HotA-H)は、一つを除き複製終結領域に有ること、調べた全てが、大腸菌の組換えホットスポットとして既に知られているChi活性を有していること、その内の3ケは、複製終結反応に依存すること、少なくともHotA活性はChi配列にも依存することを明らかにした。本年度は、(1)Hot活性は野性株においても、検出できるか?(2)Hot活性は真に組換え活性を反映しているか?について調べた。(1)野性株においても、そのHot活性はRNaseH変異株に較べると低いものの認められた。しかもその活性も終結反応とChi配列に依存していた。このことは、この現象が、通常起こっていることを示唆している。(2)最近他研究者から、特殊な系ではあるものの、Chi配列を有するDNA断片が、ローリングサークル型複製により増幅する結果が報告された。我々の系においても、もし同様なことが起れば、これまでのモデルは崩壊する。つまりHot活性は組換えでなく、複製能を反映していることになる。これについて調べた。方法としては、1)HotAのChi配列を共に破壊し、2)HotAと複製終結点(TerB)との間に、新しいChi配列(両方向)を挿入した。その結果、HotA自身にChi配列が無くても、その外に新しく挿入したChi配列(元と同方向)があれば、HotA活性が回復することが判明した。以上の結果から、これまで不明であった、環状染色体上のRecBCD酵素の侵入口の一つが、複製終結点であることがほぼ確かとなった。

为了阐明同源重组机制，对频率增加的重组热点的分析似乎是有效的。当您考虑突变器在阐明自发突变机制中起的作用时，这可能很明显。我们发现在大肠杆菌的RNaseH缺陷突变体中，热点特别升高，并进行了分析。具体而言，据透露，除了一个外，总共八个热点（Hota-H）位于复制终止区域中，并且所有测试都具有CHI活性，已经称为大肠杆菌中的重组热点，其中三个取决于复制终止反应，至少HOTA活性也取决于CHI序列。今年，我们调查了（1）即使在野生菌株中是否可以检测到热活动？（2）热活动确实反映了重组活动吗？（1）即使在野生菌株中，观察到热活动，尽管低于RNASEH突变菌株的热活动。此外，它的活性还取决于终止反应和CHI序列。这表明这种现象通常发生。（2）最近，其他研究人员报道说，具有CHI序列的DNA片段通过滚动圆形复制而放大，尽管它们很特别。如果在我们的系统中发生同样的情况，则先前的模型将崩溃。换句话说，热活动不是重组，而是反映复制能力。我调查了这个。该方法包括1）破坏HOTA的CHI序列和2）在HOTA和复制终点（TERB）之间插入新的CHI序列（两个方向）。结果，发现即使Hota本身没有CHI序列，如果有新插入的CHI序列（与原始方向相同），HOTA活动也会恢复。从上面的结果来看，几乎可以肯定的是，圆形染色体上RECBCD酶先前未知的入口之一是复制终止点。