複製終結点付近に見られる高頻度相同的組換え機構

在复制终止点附近观察到的高频同源重组机制

基本信息

批准号：
04262211
负责人：
堀内嵩
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Okazaki National Research Institutes
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至 1992
项目状态：
已结题

项目摘要

相同的組換え機構の解明には、その頻度が上昇した組換えのホットスポットの解析が有効と思われる。このことは、自然突然変異の機構解明にミューテーターの果たした役割を考えれば明かであろう。我々は大腸菌のRNaseH欠損変異株において、特に顕著に上昇するホットスポットを見いだし、解析を進めきた。具体的には、計8ケ所のホットスポット(HotA-H)は、一つを除き複製終結領域に有ること、調べた全てが、大腸菌の組換えホットスポットとして既に知られているChi活性を有していること、その内の3ケは、複製終結反応に依存すること、少なくともHotA活性はChi配列にも依存することを明らかにした。本年度は、(1)Hot活性は野性株においても、検出できるか?(2)Hot活性は真に組換え活性を反映しているか?について調べた。(1)野性株においても、そのHot活性はRNaseH変異株に較べると低いものの認められた。しかもその活性も終結反応とChi配列に依存していた。このことは、この現象が、通常起こっていることを示唆している。(2)最近他研究者から、特殊な系ではあるものの、Chi配列を有するDNA断片が、ローリングサークル型複製により増幅する結果が報告された。我々の系においても、もし同様なことが起れば、これまでのモデルは崩壊する。つまりHot活性は組換えでなく、複製能を反映していることになる。これについて調べた。方法としては、1)HotAのChi配列を共に破壊し、2)HotAと複製終結点(TerB)との間に、新しいChi配列(両方向)を挿入した。その結果、HotA自身にChi配列が無くても、その外に新しく挿入したChi配列(元と同方向)があれば、HotA活性が回復することが判明した。以上の結果から、これまで不明であった、環状染色体上のRecBCD酵素の侵入口の一つが、複製終結点であることがほぼ確かとなった。

为了阐明同源重组机制，分析频率增加的重组热点似乎是有效的。当我们考虑突变子在阐明自发突变机制中所发挥的作用时，这一点就变得清晰起来。我们在 RNaseH 缺陷型大肠杆菌突变株中发现了一个特别显着升高的热点，并继续进行分析。具体来说，位于复制终止区的八个热点 (HotA-H) 中除一个外均被发现具有 Chi 活性，这已被称为大肠杆菌中的重组热点。我们澄清了其中三个活性取决于。复制终止反应，并且至少 HotA 活性也取决于 Chi 序列。今年，我们研究了（1）即使在野生菌株中也能检测到 Hot 活性吗？（2）Hot 活性是否真正反映了重组活性？ (1) 在野生株中也观察到了热活性，尽管其低于 RNaseH 突变株。此外，其活性还取决于终止反应和Chi序列。这表明这种现象是正常发生的。 (2)其他研究人员最近报道了含有Chi序列的DNA片段通过滚环复制进行扩增，尽管这是一个特殊的系统。如果类似的事情发生在我们的系统中，之前的模型就会崩溃。换句话说，热活性反映的是复制能力，而不是重组能力。我对此进行了调查。该方法涉及 1) 破坏 HotA 的两个 Chi 序列，以及 2) 在 HotA 和复制终止点 (TerB) 之间插入一个新的 Chi 序列（双向）。结果发现，即使HotA本身没有Chi序列，如果有新插入的Chi序列（与原来方向相同），HotA活性也能恢复。从上述结果几乎可以肯定，迄今未知的环状染色体上RecBCD酶的进入点之一就是复制终止点。