新しい内在性小分子RNAによるDECODE調節機構とRNAiの関係の解明

一种新的内源性小RNA阐明DECODE调控机制与RNAi之间的关系

基本信息

批准号：
18055018
负责人：
田原浩昭
金额：
$ 4.8万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18055018/
关键词：
RNAi 線虫 C. elegans C.elegans

项目摘要

RNAiとは真核生物の細胞に二本鎖RNAを導入した場合に相同配列を持つ遺伝子の発現抑制が生じる現象であり、遺伝子発現を制御する新しい手段として有用である。我々は線虫C. elegansをモデル生物として用いてRNAiの反応機構について研究を行っている。これまで不十分であった生化学的な解析を進めるために、線虫の細胞抽出液を用いてRNAiを再現する無細胞反応系を本研究の準備期間に開発してきた。前年度の研究において、線虫の細胞抽出液中で長いRNAの導入に伴ってsiRNAに類似した小分子RNAを産生するRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRP)の活性を見いだしていた。本年度にさらに詳しい解析を進めたところ、そのRdRP活性はRdRPドメインを持つRRF-1に主として対応することが分かった。そして、RRF-1複合体によってin vitroで合成された小分子RNAはDicerの産物である一次型siRNAとは構造が異なっており二次型siRNAの特徴を持っていること、RRF-1が合成した産物の多くは5'末端にグアニンを持つことを明らかとした。又、線虫におけるRNAi反応下流におけるmRNAの配列特異的な切断(RISC)活性を無細胞反応系で検出してきており、その活性を担う分子実体を探索した。様々なRNAi欠損変異体から細胞抽出液を調製しRISC活性を測定する実験を行った結果、二次型siRNAによって誘導されるRISC活性がArgonaute変異体の一つであるcsr-1において損なわれていることを見つけた。又、CSR-1のリコンビナント蛋白が二次型siRNAと一緒にmRNA切断活性を示すことも確認した。

RNAi是当双链RNA被引入真核细胞时，具有同源序列的基因的表达受到抑制的现象，并且可作为控制基因表达的新手段。我们正在以线虫秀丽隐杆线虫为模式生物，开展RNAi反应机制的研究。为了推进迄今为止还不够充分的生化分析，我们在本研究的准备期间开发了一种使用秀丽隐杆线虫细胞提取物再现RNAi的无细胞反应系统。在去年的研究中，我们发现了RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）的活性，当将长RNA引入线虫细胞提取物时，该酶会产生类似于siRNA的小RNA。今年进一步详细的分析表明，RdRP活性主要对应于具有RdRP结构域的RRF-1。 RRF-1复合物在体外合成的小RNA具有与Dicer产生的初级siRNA不同的结构，并且具有次级siRNA的特征。据揭示，这些产物中的许多在5'末端具有鸟嘌呤。此外，我们使用无细胞反应系统检测了秀丽隐杆线虫RNAi反应下游的mRNA序列特异性切割（RISC）活性，并寻找负责该活性的分子实体。通过从各种 RNAi 缺陷突变体中制备细胞提取物并测量 RISC 活性的实验，我们发现 csr-1（我发现的 Argonaute 突变体之一）中由二级 siRNA 诱导的 RISC 活性受损。我们还证实重组 CSR-1 蛋白与二级 siRNA 一起表现出 mRNA 切割活性。