新しい内在性小分子RNAによるDECODE調節機構とRNAiの関係の解明

一种新的内源性小RNA阐明DECODE调控机制与RNAi之间的关系

基本信息

批准号：
18055018
负责人：
田原浩昭
金额：
$ 4.8万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18055018/
关键词：
RNAi 線虫 C. elegans C.elegans

项目摘要

RNAiとは真核生物の細胞に二本鎖RNAを導入した場合に相同配列を持つ遺伝子の発現抑制が生じる現象であり、遺伝子発現を制御する新しい手段として有用である。我々は線虫C. elegansをモデル生物として用いてRNAiの反応機構について研究を行っている。これまで不十分であった生化学的な解析を進めるために、線虫の細胞抽出液を用いてRNAiを再現する無細胞反応系を本研究の準備期間に開発してきた。前年度の研究において、線虫の細胞抽出液中で長いRNAの導入に伴ってsiRNAに類似した小分子RNAを産生するRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRP)の活性を見いだしていた。本年度にさらに詳しい解析を進めたところ、そのRdRP活性はRdRPドメインを持つRRF-1に主として対応することが分かった。そして、RRF-1複合体によってin vitroで合成された小分子RNAはDicerの産物である一次型siRNAとは構造が異なっており二次型siRNAの特徴を持っていること、RRF-1が合成した産物の多くは5'末端にグアニンを持つことを明らかとした。又、線虫におけるRNAi反応下流におけるmRNAの配列特異的な切断(RISC)活性を無細胞反応系で検出してきており、その活性を担う分子実体を探索した。様々なRNAi欠損変異体から細胞抽出液を調製しRISC活性を測定する実験を行った結果、二次型siRNAによって誘導されるRISC活性がArgonaute変異体の一つであるcsr-1において損なわれていることを見つけた。又、CSR-1のリコンビナント蛋白が二次型siRNAと一緒にmRNA切断活性を示すことも確認した。

RNAi是一种现象，其中将双链RNA引入真核细胞中，从而导致具有同源序列的基因表达抑制，并且可作为控制基因表达的新手段。我们正在使用线虫C.秀丽隐杆线虫作为模型生物体来研究RNAi的机制。为了进行迄今为止还不够的生化分析，在本研究的准备期间，已经开发了一种使用线虫细胞提取物再现RNAi的无细胞反应系统。在上一年的研究中，我们发现了RNA依赖性RNA聚合酶（RDRP）的活性，该活性产生了类似于siRNA的小分子RNA，以及在线虫细胞提取物中引入长RNA。今年的进一步分析表明，其RDRP活性主要对应于具有RDRP域的RRF-1。还揭示了由RRF-1复合物在体外合成的小分子RNA的结构不同于原代siRNA，这是DICER的产物，而由RRF-1合成的许多产物在5'端具有鸟嘌呤。此外，在无细胞反应系统中检测到了线虫中RNAi反应下游mRNA的序列特异性裂解（RISC）活性，并且已经搜索了负责该活性的分子实体。从各种RNAi缺陷型突变体中制备细胞提取物并测量RISC活性后，我们发现由继发性siRNA诱导的RISC活性在CSR-1中受损，CSR-1是Argonaute突变体之一。还证实，CSR-1的重组蛋白与次级siRNA一起表现出mRNA裂解活性。