mRNAを標的とする遺伝情報のDECODE調節としてのRNAi機構の解明

阐明 RNAi 机制作为针对 mRNA 的遗传信息的解码调节

基本信息

批准号：
17054021
负责人：
田原浩昭
金额：
$ 2.82万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17054021/
关键词：
RNAi 線虫 C.elegans

项目摘要

RNAi(RNA interference)とは真核生物の細胞に二本鎖RNAを導入した場合に相同配列を持つ遺伝子の発現抑制が生じる現象であり、線虫C.elegansで最初に発見された。遺伝子発現を制御する新しい手段として、基礎研究のみならず将来の医療や植物育種等へのRNAiの応用が期待されている。我々の研究グループは線虫をモデル生物として用いてRNAiの分子機序の解明に取り組んでいる。RNAiをRNAの分解反応の流れとして捉える場合、in vitroの無細胞反応系でRNAiを再現して解析することが有効な研究手法として考えられる。そこで、線虫の細胞抽出液を用いてRNAiを再現する無細胞反応系の開発を行った。粗精製した細胞抽出液を用いる工夫によって、RNAi反応において上流で長い二本鎖RNAを小分子RNAに分解するDicer(RNaseIII)活性および下流で標的mRNAを破壊するRISC活性、それぞれを検出する実験系の開発に成功した。RNAiは線虫で最初に発見された現象であるが、線虫におけるRISCの実体は未だ不明であり解明が求められている。現在、RISCの生化学的精製を進めているところである。又、生化学的に同定されてくる分子については、対応する遺伝子の破壊変異体を単離して個体レベルで機能を検証することが望ましい。そこで、ゲノムにランダムに欠失変異を生じさせた線虫集団を凍結保存ライブラリー化して、PCRスクリーニングによって目的遺伝子に欠失を持つ変異体を単離するシステムを構築した。

RNAi（RNA干扰）是当双链RNA被引入真核细胞时，具有同源序列的基因的表达被抑制的现象，并且首先在线虫中发现。 RNAi作为一种控制基因表达的新手段，有望不仅应用于基础研究，还将应用于未来的医疗保健和植物育种中。我们的研究小组正在利用秀丽隐杆线虫作为模式生物来阐明RNAi的分子机制。当将 RNAi 视为 RNA 降解反应流程时，一种有效的研究方法是在体外无细胞反应体系中重现和分析 RNAi。因此，我们开发了一种使用秀丽隐杆线虫细胞提取物再现 RNAi 的无细胞反应系统。成功开发了一种实验系统，该系统使用粗纯化的细胞提取物来检测 Dicer (RNaseIII) 活性，该活性将上游的长双链 RNA 降解为小 RNA 分子，以及在 RNAi 反应中破坏下游目标 mRNA 的 RISC 活性。 RNAi 是一种首先在秀丽隐杆线虫中发现的现象，但 RISC 在秀丽隐杆线虫中的实际性质仍然未知，需要澄清。我们目前正在推进 RISC 的生化纯化。此外，对于已通过生化鉴定的分子，需要分离相应基因的破坏突变体并在个体水平验证其功能。因此，我们创建了基因组中随机缺失突变的线虫种群的冻存文库，并构建了通过PCR筛选分离目标基因缺失突变体的系统。