2本鎖RNAによる遺伝子発現抑制機構の研究

双链RNA基因表达抑制机制研究

基本信息

批准号：
01J01904
负责人：
田原浩昭
金额：
$ 1.73万
依托单位：
National Institute of Genetics (2002)The University of Tokushima (2001)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J01904/
关键词：
RNAi C. elegans 抗体

项目摘要

RNAiとは、生物に2本鎖RNA (dsRNA)を投与した場合に相同な配列を持つmRNAの分解が生じる現象であり、基礎研究のための遺伝子発現抑制の新しい手法としてのみならず将来の医療分野への応用も期待されている。RNAi現象の分子機序の実体を解明するために、筆者はモデル生物として線虫C. elegansを用いて研究を行ってきている。筆者はこれまでに、dsRNAの導入に伴うRNAi反応に関与する因子を幾つか同定してきており、その因子の1つであるrde-1に着目して本年度の研究を行った。まずRDE-1のN末領域に対応するリコンビナント蛋白を作製し、ラットとウサギに対して免疫して抗体を作製した。次に、精製した抗RDE-1抗体を用いた免疫沈降実験によって、RDE-1がin vivoで相互作用している蛋白の候補を4種得た。質量分析による解析の結果、相互作用を示す蛋白の1つであるp40がII番染色体上の遺伝子に由来することがわかった。又、筆者は、RNAi反応に関与する因子を同定するためにRNAi活性を欠損した変異体rdeを単離してきた。これまでのスクリーニングにおいてはrde-1遺伝子に対する変異が多く出現し、その他のRNAi関与遺伝子に対する変異が得られる確率が低いことが問題点であった。そこで、新しいタイプのrde変異体を効率良く単離するために、rde-1遺伝子を多コピー導入したトランスジェニック線虫を作製することにより、rde-1変異体を避けて遺伝学的スクリーニングを行うシステムを開発した。

RNAi是当双链RNA（dsRNA）被给予生物体时，具有同源序列的mRNA被降解的现象，它不仅是一种抑制基因表达的新方法，用于基础研究，而且也用于未来的医学治疗。预计也将应用于其他领域。为了阐明RNAi现象背后的分子机制，作者一直以线虫秀丽隐杆线虫为模式生物进行研究。到目前为止，作者已经确定了与引入 dsRNA 相关的 RNAi 反应所涉及的几个因素，今年的研究重点是其中一个因素，rde-1。首先，我们创建了与 RDE-1 N 末端区域相对应的重组蛋白，并免疫大鼠和兔子以产生抗体。接下来，通过使用纯化的抗RDE-1抗体的免疫沉淀实验，我们获得了四种在体内与RDE-1相互作用的候选蛋白。质谱分析结果发现，相互作用蛋白之一的p40源自II号染色体上的基因。此外，作者还分离出了一种缺乏RNAi活性的突变体rde，以便鉴定参与RNAi反应的因素。之前筛查的问题是rde-1基因出现了很多突变，而其他RNAi相关基因获得突变的概率很低。因此，为了有效地分离新类型的rde突变体，我们将通过构建引入多个拷贝的rde-1基因的转基因线虫来进行遗传筛选以避免rde-1突变体。