2本鎖RNAによる遺伝子発現抑制機構の研究

双链RNA基因表达抑制机制研究

基本信息

批准号：
01J01904
负责人：
田原浩昭
金额：
$ 1.73万
依托单位：
National Institute of Genetics (2002)The University of Tokushima (2001)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J01904/
关键词：
RNAi C. elegans 抗体

项目摘要

RNAiとは、生物に2本鎖RNA (dsRNA)を投与した場合に相同な配列を持つmRNAの分解が生じる現象であり、基礎研究のための遺伝子発現抑制の新しい手法としてのみならず将来の医療分野への応用も期待されている。RNAi現象の分子機序の実体を解明するために、筆者はモデル生物として線虫C. elegansを用いて研究を行ってきている。筆者はこれまでに、dsRNAの導入に伴うRNAi反応に関与する因子を幾つか同定してきており、その因子の1つであるrde-1に着目して本年度の研究を行った。まずRDE-1のN末領域に対応するリコンビナント蛋白を作製し、ラットとウサギに対して免疫して抗体を作製した。次に、精製した抗RDE-1抗体を用いた免疫沈降実験によって、RDE-1がin vivoで相互作用している蛋白の候補を4種得た。質量分析による解析の結果、相互作用を示す蛋白の1つであるp40がII番染色体上の遺伝子に由来することがわかった。又、筆者は、RNAi反応に関与する因子を同定するためにRNAi活性を欠損した変異体rdeを単離してきた。これまでのスクリーニングにおいてはrde-1遺伝子に対する変異が多く出現し、その他のRNAi関与遺伝子に対する変異が得られる確率が低いことが問題点であった。そこで、新しいタイプのrde変異体を効率良く単離するために、rde-1遺伝子を多コピー導入したトランスジェニック線虫を作製することにより、rde-1変異体を避けて遺伝学的スクリーニングを行うシステムを開発した。

RNAi是一种现象，当将双链RNA（DSRNA）施用到生物体时，具有同源序列的mRNA发生，并且预计它不仅可以用作抑制基因表达的新方法，用于基础研究，而且在未来的医学领域中。为了阐明RNAi现象的分子机制，作者一直在使用线虫秀丽隐杆线虫作为模型生物进行研究。迄今为止，作者已经确定了与引入DSRNA有关的RNAi响应涉及的几个因素，并进行了今年的研究，重点是其中一个因素RDE-1。首先，制备了与RDE-1的N末端区域相对应的重组蛋白，并通过对大鼠和兔子进行免疫制备抗体。接下来，通过使用纯化的抗RDE-1抗体进行免疫沉淀实验，获得了四种候选蛋白，其中RDE-1相互作用。质谱法分析表明，p40是一种相互作用的蛋白质之一，起源于II染色体上的基因。作者还分离了缺乏RNAi活性来识别RNAi响应涉及的因素的突变体RDE。先前的筛选是有问题的，因为已经出现了RDE-1基因的许多突变，并且获得其他与RNAi相关基因的突变的概率很低。因此，为了有效地分离新型的RDE突变体，我们通过生成带有多个RDE-1基因的转基因线虫来开发了一种用于遗传筛查的系统，避免了RDE-1突变体。