線虫を用いたRNAi関与因子の遺伝子的同定と機能解析

利用秀丽隐杆线虫进行 RNAi 相关因子的遗传鉴定和功能分析

• 批准号: 17026020
• 负责人: 田原 浩昭
• 金额: $ 3.39万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17026020/
• 关键词: RNAi; 線虫; C.elegans

RNAi(RNA interference)とは真核生物の細胞に二本鎖RNAを導入した場合に相同配列を持つ遺伝子の発現抑制が生じる現象であり、遺伝子発現を制御する新しい手段として有用である。我々は線虫C.elegansをモデル生物として用いてRNAiの反応機構について生化学と遺伝学を組み合わせた研究を行った。生化学的な解析を進めるために、初年度およびその準備期間に、線虫の細胞抽出液を用いてRNAiを再現する無細胞反応系を独自に開発してきた。本年度は開発した無細胞反応系を用いて、RNAiにおける標的mRNAの切断反応およびシグナル増幅機構について解析した。まず、無細胞系へmRNA及び合成siRNAを導入する実験によって、mRNAの配列特異的な切断(Slicer)活性の検出を行った。興味深いことに、線虫におけるSlicer活性は2本鎖のsiRNAよりも1本鎖のsiRNAでより強く誘導できるという特徴を持つことが分かった。又、植物や菌類そして線虫においてはRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRP)がRNAi反応に必要とされることが知られており、そのRdRP活性を無細胞系で検出することを試みた。その結果、不完全な形状のmRNAを鋳型として22〜23塩基長の小分子RNAを合成するRdRP活性を検出できた。この活性は、RNAi反応機構の下流において標的mRNAを鋳型として2次的siRNAが産生されるシグナル増幅反応に対応するものと考えられる。又、既知のRNAi欠損変異体の中の数種類がRdRP活性の異常を示すことも判明した。

RNAi（RNA干扰）是一种现象，其中将双链RNA引入真核细胞中，从而导致具有同源序列的基因表达抑制，并且可作为控制基因表达的新手段。我们使用线虫秀丽隐杆线虫作为模型生物，对RNAi的反应机理进行了合并的生物化学和遗传学研究。为了推进生化分析，我们已经独立开发了一种无细胞的反应系统，该系统使用线虫细胞提取物在第一年和制备期间重现RNAi。今年，我们分析了靶mRNA在RNAi中的裂解反应以及使用无细胞反应系统开发的信号扩增的机理​​。首先，通过实验检测到mRNA的序列特异性裂解（切片）活性，其中mRNA和合成siRNA被引入无细胞系统中。有趣的是，发现在线虫中，单链siRNA比双链siRNA更强烈地诱导了线虫的切片活性。还知道RNA依赖性RNA聚合酶（RDRP）是植物，真菌和线虫中RNAi反应所必需的，并尝试检测无细胞系统中其RDRP活性。结果，检测到RDRP活性，该活性使用不完全形状的mRNA作为模板合成了长度为22至23个碱基的小分子RNA。该活性被认为对应于一种信号扩增反应，其中使用靶mRNA作为RNAi反应机下游产生次级siRNA。还发现几个已知的RNAi缺陷突变体表现出异常的RDRP活性。