線虫を用いたRNAi関与因子の遺伝子的同定と機能解析

利用秀丽隐杆线虫进行 RNAi 相关因子的遗传鉴定和功能分析

基本信息

批准号：
17026020
负责人：
田原浩昭
金额：
$ 3.39万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17026020/
关键词：
RNAi 線虫 C.elegans

项目摘要

RNAi(RNA interference)とは真核生物の細胞に二本鎖RNAを導入した場合に相同配列を持つ遺伝子の発現抑制が生じる現象であり、遺伝子発現を制御する新しい手段として有用である。我々は線虫C.elegansをモデル生物として用いてRNAiの反応機構について生化学と遺伝学を組み合わせた研究を行った。生化学的な解析を進めるために、初年度およびその準備期間に、線虫の細胞抽出液を用いてRNAiを再現する無細胞反応系を独自に開発してきた。本年度は開発した無細胞反応系を用いて、RNAiにおける標的mRNAの切断反応およびシグナル増幅機構について解析した。まず、無細胞系へmRNA及び合成siRNAを導入する実験によって、mRNAの配列特異的な切断(Slicer)活性の検出を行った。興味深いことに、線虫におけるSlicer活性は2本鎖のsiRNAよりも1本鎖のsiRNAでより強く誘導できるという特徴を持つことが分かった。又、植物や菌類そして線虫においてはRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRP)がRNAi反応に必要とされることが知られており、そのRdRP活性を無細胞系で検出することを試みた。その結果、不完全な形状のmRNAを鋳型として22〜23塩基長の小分子RNAを合成するRdRP活性を検出できた。この活性は、RNAi反応機構の下流において標的mRNAを鋳型として2次的siRNAが産生されるシグナル増幅反応に対応するものと考えられる。又、既知のRNAi欠損変異体の中の数種類がRdRP活性の異常を示すことも判明した。

RNAi（RNA干扰）是当双链RNA被引入真核细胞时，具有同源序列的基因的表达受到抑制的现象，并且可作为控制基因表达的新手段。我们以线虫秀丽隐杆线虫为模式生物，结合生物化学和遗传学对RNAi反应机制进行了研究。为了推进生化分析，在第一年和准备期间，我们独立开发了利用线虫细胞提取物再现RNAi的无细胞反应系统。今年，我们利用开发的无细胞反应体系来分析RNAi中靶标mRNA切割反应和信号放大机制。首先，我们在将 mRNA 和合成 siRNA 引入无细胞系统的实验中检测了 mRNA 的序列特异性切片（切片器）活性。有趣的是，发现单链 siRNA 比双链 siRNA 更能强烈诱导线虫中的 Slicer 活性。此外，众所周知，植物、真菌和线虫中的 RNAi 反应需要依赖 RNA 的 RNA 聚合酶 (RdRP)，我们尝试在无细胞系统中检测 RdRP 活性。结果，我们能够检测到 RdRP 活性，它使用形状不完美的 mRNA 作为模板合成长度为 22 至 23 个碱基的小 RNA。这种活性被认为对应于信号放大反应，其中使用靶mRNA作为RNAi反应机制下游的模板来产生次级siRNA。还发现一些已知的 RNAi 缺陷突变体表现出 RdRP 活性异常。