線虫をモデル生物としたRNAi反応機構の分子遺伝学的解析

以秀丽隐杆线虫为模式生物的RNAi反应机制的分子遗传学分析

基本信息

批准号：
16770004
负责人：
田原浩昭
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16770004/
关键词：
RNAi 線虫 C.elegans 遺伝学

项目摘要

RNAi(RNA interference)とは真核生物の細胞に二本鎖RNAを導入した場合に相同配列を持つ遺伝子の発現抑制が生じる現象であり、線虫Celegansで最初に発見された。遺伝子発現を制御する新しい手段として、基礎研究のみならず将来の医療や植物育種等へのRNAiの応用が期待されている。我々の研究グループは線虫をモデル生物として用いてRNAiの分子機序の解明に取り組んでいる。RNAiをRNAの分解反応の流れとして捉える場合、in vitroの無細胞反応系でRNAiを再現して解析することが有効な研究手法として考えられる。そこで、線虫の細胞抽出液を用いてRNAiを再現する無細胞反応系の開発を行った。粗精製した細胞抽出液を用いる工夫によって、RNAi反応において上流で長い二本鎖RNAを小分子RNAに分解するDicer(RNaseIII)活性および下流で標的mRNAを破壊するRISC活性、それぞれを検出する実験系の開発に成功した。RNAiは線虫で最初に発見された現象であるが、線虫におけるRISCの実体は未だ不明であり解明が求められている。現在、RISCの生化学的精製を進めているところである。又、生化学的に同定されてくる分子については、対応する遺伝子の破壊変異体を単離して個体レベルで機能を検証することが望ましい。そこで、ゲノムにランダムに欠失変異を生じさせた線虫集団を凍結保存ライブラリー化して、PCRスクリーニングによって目的遺伝子に欠失を持つ変異体を単離するシステムを構築した。

RNAi（RNAi）是一种现象，当将双链RNA引入本机生物的细胞中时，可以用家乡序列抑制基因的表达，并首先在线性名人中发现。作为控制遗传表达的一种新手段，预计RNAi不仅将应用于基础研究，还将应用于未来的医疗和植物育种。我们的研究小组正在努力使用昆虫作为模型生物阐明RNAi分子机制。当将RNAi视为RNA分解反应的流动时，它被认为是一种有效的研究方法，可以用体外的无细胞系统再现和分析RNAi。因此，我们开发了一种无细胞的反应系统，该系统使用昆虫的细胞提取物再现RNAi。 DICER（RNASEIIIII），将RNAi反应中的长双链RNA打破了小分子RNA，并破坏了RNAi反应中靶标mRNA的RISC活性，RISC活性在下游成功发展中检测到目标mRNA 。 RNAi是线条中发现的第一个现象，但是昆虫中RISC的实体仍然未知，必须阐明。目前，RISC正在接受生化纯化。此外，对于通过生化鉴定的分子，希望识别相应基因的相应基因并在单个水平上验证功能。因此，构建了一个系统是一个随机导致基因组缺失的库组的冰冻和保存完好的库，并且通过PCR筛选浪费的系统被隔离为孤立的一个孤立的突变体，该突变体失去了所需的基因。