大脳皮質回路形成過程のGABAA受容体・C1-輸送体・タウリンの機能協関

GABAA受体、C1转运蛋白和牛磺酸在大脑皮层回路形成过程中的功能配合

基本信息

批准号：
18021015
负责人：
福田敦夫
金额：
$ 4.22万
依托单位：
Hamamatsu University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

1. Cl^-トランスポーターknock-downによる細胞移動の[Cl^-]_i依存性の検討[熊田、福田]:NKCC1 mRNAの転写を干渉するshRNAをコードするコンストラクトのプラスミドを調整し、計画1.で用いたHcRedプラスミドと同時に電気穿孔法で胎仔脳室帯の新生神経細胞に導入した。2種類のプラスミドは90%以上の高率で同一の細胞に導入されるので、HcRedを発現レた細胞にはSiRNAも導入されていることになる。こうしてNKCC1遺伝子の転写をsiRNAでknock-downして、Cl^-濃度を調節したホールセルパッチクランプで[Cl^-]_iを測定したところ平均値は過分極側にシフトした。しかし、目下のところradial移動の顕著な異常はでていないので、HcRedのみの場合の移動との比較の必要性が示唆された。NKCC1mRNAの減少を確認するためreal-time PCR法を行った。2. 排出型Cl^-輸送体KCC2の機能発現抑制因子の検討[福田・古川]:KCC2にはいくつかのリン酸化部位が知られており、リン酸化あるいは脱リン酸化によってCl^-排出能が抑制されている可能性を検討するため、リン酸化阻害剤(スタウロスポリン)および脱リン酸化阻害剤(5酸化バナジウム酸)をスライスに投与して[Cl^-]_i変化を測定した。しかし、ラット胎生18日の移動細胞ではいずれにおいても変化を認めなかった。ところが、生後1週前後のKCC2が機能し始める時期で同様の実験を行うとKCC2過剰発現細胞において[Cl^-]_iが有意に減少し、広範性リン酸化阻害剤で[Cl^-]_iが低下した。すなわち、生後1週ではリン酸化によるKCC2機能抑制がおこるが、細胞移動期の胎生18日ではこのプロセスが起こらないことが示唆された。

1。cl^ - 转运蛋白敲低的细胞转移[cl^ - ] _ i依赖性[kumada，fukuda]：调整编码shRNA的构建体的质粒，该构建体的shRNA的质粒会干扰NKCCC1 mRNA的转移，计划1在同一计划处。时间作为HCRED质粒所使用的时间，通过电穿孔方法将其引入了胎儿室的神经切开术细胞。由于将两种类型的质粒以高度超过90％的速率引入相同细胞，因此已将siRNA引入表达HCRED的细胞。这样，在siRNA中将NKCC1基因的转移被敲低，并且当[Cl^ - ] _ i被用Cl^ - 浓度测量[Cl^ - ] _ i时，平均值转移到了过度极点。调整。但是，目前尚无径向运动的显着异常，这表明需要与HCRED的运动进行比较。进行实时PCR方法以确认NKCC1MRNA的降低。 2。运输KCC2的功能表达抑制因子的排气型Cl^ - kcc2以某些磷酸化的部分而闻名，Cl^ - 由于磷酸化或LIN氧化而引起的CL^释放。，将磷酸化的抑制剂（星形孢菌素）和剂量抑制（5个氧化物）（5氧化物）（5个氧化物）（5个氧化物）（5氧化物）施用到切片上，以测量[Cl^ - ] _ i的变化。但是，在任何情况下，大鼠胎儿18号的移动细胞都没有得到认可。但是，如果在KCC2出生后一周开始使用KCC2时进行相同的实验，则[Cl^ - ] _ i在KCC2 OVERREA细胞中显着降低，并且具有广泛的磷酸化抑制剂[ cl^ - ] _ I.已下降。换句话说，有人提出此过程不会在出生后的第一周发生，但是KCC2功能被磷酸化抑制，但是此过程不会在细胞移动期的第18天发生。