ALPHASCREENによるソフトな膜タンパク質間相互作用の解析法開発

使用 ALPHASCREEN 开发软膜蛋白质相互作用分析方法

基本信息

批准号：
16048205
负责人：
中尾洋一
金额：
$ 2.3万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16048205/
关键词：
MMP 海洋無脊椎動物阻害剤がん転移血管新生タンパク質間相互

项目摘要

平成16年度の研究では、がん細胞の浸潤や血管新生における血管内皮細胞の遊走に必須であるMMP2/TIMP2/MT1-MMPの安定複合体と接着分子CD44との間のソフトな相互作用を検出するために、ALPHASCREENを用いたソフトな相互作用検出法を開発し、この相互作用を阻害する低分子性化合物を探索することを目的として研究を行った。今年度の研究成果の概要を以下に述べる。MT1-MMPおよびCD44に対して、当初はアクセプターおよびドナービーズに固定したそれぞれの抗体を介してタンパク質間の相互作用を検出する予定であったが、3カ所での相互作用の形成(抗体1/MT1-MMP/CD44/抗体2)が必要となるため、検出感度が悪く相互作用の検出ができなかった。また、MT1-MMPは複合体を形成させている間に自己消化を起こしてしまい、バラバラのフラグメントになったものでは相互作用が起きないことも明らかになった。そこで、自己消化を防ぐためにMMP阻害剤をバッファー中に添加し、さらにCD44をドナービーズに直接固定化することで相互作用を2カ所に減らしたところ、384穴マイクロプレートを用いた小スケールアッセイにおいて、タンパク質の検出感度1pmol(100-200ng/サンプル)程度で相互作用を検出することに成功した。また、CD44のステム領域とMT1-MMPの結合部位(ヘモペキシン様ドメイン:PEX)を、それぞれ直接固定したビーズを用いて、CD44とMT1-MMPの相互作用をダイレクトに検出する高感度アッセイの検討を行っている。アッセイに用いるPEXを供給するため、大腸菌を用いて組み換えPEXの発現系を導入した。なお、組み換えPEXは分子量が2万程度でNMR測定が可能となるため、今年度中に^<15>Nでラベルしたタンパク質を用いてNMRによる相互作用の検証を行う予定である。一方、本アッセイで用いるALPHAビーズは蛍光顕微鏡下で観察可能なことから、抗MMP抗体コートしたALPHAビーズをヒト子宮がん由来HeLa細胞培養液中に添加したところ、MMPが局在している細胞の浸潤突起に結合している様子が観察された。そこで、ALPHAビーズと蛍光タイムラプスイメージングを組み合わせて、MMP2/TIMP2/MT1-MMP複合体の細胞表面上での挙動を一分子単位で観察できるシステムの構築を検討中である。さらに、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、680nmのレーザー光をあてると相互作用を起こしているALPHAビーズだけが蛍光を発することを確認できたため、生細胞表面で起きている膜タンパク質間相互作用の検出法についても検討中である。

在2004年的研究中，我们使用Alphascreen开发了一种软相互检测方法，以检测MMP2/TIMP2/MT1-MMP的稳定复合物之间的软相互作用，这对于癌细胞浸润和血管生成过程中的血管内皮细胞迁移至关重要，并进行了一项研究，目的是探索这种小分子化合物的相互作用。以下是今年研究结果的概述。最初，它计划通过固定在受体和供体珠上的相应抗体来检测MT1-MMP和CD44的蛋白质之间的相互作用，但是由于在三个位置形成相互作用（抗体1/MT1-MMP/CD44/抗体2）以来，需要检测敏感性，并且无法检测敏感性。还揭示了MT1-MMP自溶发生在复合物的形成过程中，并且在脱节的片段中没有相互作用。因此，为了防止自溶，将MMP抑制剂添加到缓冲液中，并且将CD44直接固定在供体珠上，以将相互作用减少到两个位置。在使用384孔微板岩的小尺度测定中，与蛋白质检测敏感性（约1 pmol（100-200 ng/样品））成功检测到了相互作用。我们还研究了一种高度敏感的测定法，该测定法直接使用直接固定在CD44的茎区域以及MT1-MMP的结合位点的珠（Hemopexin样结构域：PEX）的结合位点，直接检测CD44和MT1-MMP之间的相互作用。为了提供用于测定法的PEX，使用大肠杆菌引入了重组PEX表达系统。此外，由于重组PEX的分子量约为20,000，因此NMR测量是可能的，我们计划使用本财政年度使用 ^<15> N标记的蛋白质来验证NMR的相互作用。另一方面，由于可以在荧光显微镜下观察到该测定法中使用的α珠，因此将涂有抗MMP抗体涂有抗MMP抗体的α珠被添加到来自人子宫癌的HeLa细胞培养基中，因此可以观察到MMP结合到局部细胞的浸润性突起。因此，我们目前正在研究一个可以观察到单个分子上MMP2/TIMP2/MT1-MMP复合物的行为，通过将α珠与荧光延时成像相结合，以观察到MMP2/TIMP2/MT1-MMP复合物的行为。此外，还研究了仅使用共聚焦激光显微镜在680 nm处与激光光相互作用的α珠可产生荧光，并且还研究了一种检测活细胞表面上发生的膜蛋白蛋白相互作用的方法。