抗腫瘍活性を高めるエフェクター細胞および樹状細胞の選択的増幅法の開発

开发效应细胞和树突状细胞的选择性扩增方法以增强抗肿瘤活性

• 批准号: 14030017
• 负责人: 長棟 輝行
• 金额: $ 2.69万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14030017/
• 关键词: 樹状細胞; 抗体; 受容体; 遺伝子治療; がん; 選択的増幅; 細胞障害性T細胞

本研究では、生体内で免疫原性のない小分子に応答して増殖シグナルを伝達するキメラ受容体を作製することを目指した。小分子としてフルオレセイン(Fl)を選び、抗Fl抗体の可変領域一本鎖抗体(ScFv)を合成ヒト抗体cDNA libraryからphage display法で得た。続いて、エリスロポエチン受容体(EpoR)のEpo結合ドメインを抗Fl抗体のScFvで置換し、その細胞内ドメインをIL-6受容体β鎖であるgp130、IL-2Rβ鎖、IL-2Rγ鎖、c-kitで置換したキメラ受容体(それぞれScFv-gp130,ScFv-IL-2Rβ、ScFv-IL-2Rγ、ScFv-kit)発現レトロウィルスベクターを作製した。目的遺伝子のモデルとして緑色蛍光タンパク質EGFPを選び、キメラ受容体の下流に内部リボソーム結合部位(IRES)配列を介して連結した。これらのベクターをIL-3依存性血球細胞株であるBa/F3細胞に導入し、Fl標識BSA(BSA-Fl)を添加して培養したところ、細胞増殖が生じたことから、作製したキメラ受容体がFlを認識して増殖シグナルを伝達しうることが示された。続いて、回文配列を持つオリゴDNAの5'末端をFlラベルしたものをアニーリングさせることによって、Fl dimerを作製した。オリゴDNAリンカー長は、EpoRのD2ドメインのN末端間距離が約35Åであることを指標に、8mer〜14mer(30〜53Å)とした。BsA-Fl選択後の細胞を用いて、これらのFl dimerを添加したところ、いずれのキメラ受容体も細胞増殖がみられ、最適なリンカー長は12〜13mer、最適濃度は約1μMであることが分かった。また、ScFv-gp130に関しては、選択前の細胞にFl dimer(12merおよび13mer)を添加して直接選択を試みたところ、Fl dimer依存的な増殖が見られ、EGFP陽性細胞率はほぼ100%となった。以上の結果から、ScFv-受容体キメラとFl dimerによる人工的情報伝達系の有効性と遺伝子導入細胞の選択的増幅法としての応用可能性が示された。今後は樹状細胞や細胞傷害性T細胞での選択的増幅の実現可能性について検証する予定である。

在这项研究中，我们的目标是创建一种嵌合受体，它可以响应体内非免疫原性小分子而传递增殖信号。选择荧光素(Fl)作为小分子，并使用噬菌体展示方法从合成的人抗体cDNA文库中获得抗Fl抗体的单链可变区抗体(ScFv)。接下来，将促红细胞生成素受体(EpoR)的Epo结合结构域替换为抗Fl抗体的ScFv，并将其胞内结构域替换为gp130、IL-6受体β链、IL-2Rβ链和IL-2。创建了表达被 Rγ 链和 c-kit 取代的嵌合受体（分别为 ScFv-gp130、ScFv-IL-2Rβ、ScFv-IL-2Rγ 和 ScFv-kit）的逆转录病毒载体。选择绿色荧光蛋白 EGFP 作为感兴趣的模型基因，并通过内部核糖体结合位点 (IRES) 序列连接到嵌合受体的下游。当将这些载体导入Ba/F3细胞(一种IL-3依赖性血细胞系)并添加F1标记的BSA(BSA-F1)进行培养时，已表明发生了机体能够识别的细胞增殖。 Fl并传输增殖信号。接下来，通过将寡聚DNA的5'末端与用F1标记的回文序列退火来产生F1二聚体。基于 EpoR D2 结构域 N 末端之间的距离约为 35 Å，确定寡聚 DNA 接头的长度为 8 mer 至 14 mer（30 至 53 Å）。当这些Fl二聚体在BsA-Fl选择后添加到细胞中时，观察到所有嵌合受体的细胞增殖，表明最佳接头长度为12-13mer，最佳浓度约为1μM。对于ScFv-gp130，当在选择前向细胞中添加Fl二聚体(12mer和13mer)来尝试直接选择时，观察到Fl二聚体依赖性增殖，并且EGFP阳性细胞率几乎为100%。上述结果证明了使用ScFv受体嵌合体和F1二聚体的人工信号转导系统的有效性，及其作为基因转染细胞的选择性扩增方法的适用性。未来，我们计划验证树突状细胞和细胞毒性T细胞选择性扩增的可行性。