抗腫瘍活性を高めるエフェクター細胞および樹状細胞の選択的増幅法の開発

开发效应细胞和树突状细胞的选择性扩增方法以增强抗肿瘤活性

• 批准号: 13218031
• 负责人: 長棟 輝行
• 金额: $ 3.14万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13218031/
• 关键词: 樹状細胞; 抗体; 受容体; 遺伝子治療; がん; 選択的増幅

1.抗体/受容体キメラを用いた遺伝子導入細胞の選択的増幅法の開発 本研究ではまず、培養細胞レベルで抗体/受容体キメラを用いた目的遺伝子導入細胞の選択的増幅法を確立することを目指した。エリスロポエチン受容体(EpoR)のリガンド結合ドメインを抗ニワトリ卵白リゾチーム(HEL)抗体HyHEL-10の可変領域VHまたはVLに置換し、細胞内ドメインをIL-6受容体β鎖であるgp130に置換したキメラ受容体(それぞれHg、Lg)発現ベクターを作製した。さらに、目的遺伝子のモデルとして緑色蛍光タンパク質EGFPを選び、Lgの下流に内部リボソーム結合部位(IRES)配列を介して連結した(LgIGFP)。EGFP陽性細胞をHELの添加によって選択的に増幅できるかどうかを検証するために、IL-3依存性血球細胞であるBa/F3に対しレトロウイルスを用いてHgとLgIGFPの同時導入を行った。6〜7日後、IL-3を洗浄除去し、HELまたはIL-3添加培地中で選択した。選択前後におけるEGFPの発現量および陽性率をFACSによって比較した結果、選択前のEGFP陽性率は1%程度であったが、HEL添加培地中で増殖が見られ、選択後のEGFP陽性率はほぼ100%であった。それに対し、IL-3添加培地中で培養した場合は選択前の陽性率とほぼ同等であったことから、キメラ受容体由来の増殖シグナルにより遺伝子導入細胞が選択的に増幅されたと考えられる。2.遺伝子導入樹状細胞の選択的増幅 目的遺伝子とキメラ受容体を確実に同時発現させるために、Hg, LgおよびEGFPをIRESを介してタンデムに連結したレトロウィルスベクター(pMX-Hg-I-Lg-I-EGFP)を作製した。このベクターをまずBa/F3細胞に導入した結果、EGFPの発現が見られ、またHEL濃度依存的に増殖したことから、このベクターが正しく機能することが確認された。次に、マウス骨髄から樹状前駆細胞を得て、IL-6,sIL-6Rα,SCFを併用添加して培養したところ、前駆細胞を未分化状態のまま増殖維持できることが分かった。そこで、樹状前駆細胞にpMX-Hg-I-Lg-I-EGFPをレトロウイルスにより導入したところ、導入効率は1.1%と低かったものの導入できることが分かった。現在、遺伝子導入樹状前駆細胞をHELとSCFを併用添加した培地中で選択しており、経時的にEGFP陽性細胞率をFACSで測定し、本手法を用いた選択的増幅の実現可能性について検証中である。

1。在这项研究中，使用抗体/受体嵌合体选择性扩增转基因细胞的方法，我们首先旨在在培养的细胞水平上使用抗体/受体嵌合体选择一种选择性扩增转基因细胞的方法。制备了嵌合受体（HG和LG）表达载体，其中将红细胞生成素受体的配体结合结构域（EPOR）替换为抗鸡蛋白溶菌酶（HEL）抗体HYHEL-100的可变区域VH或VH或VL，并替换了gp130，替换了gp130。此外，选择了绿色荧光蛋白EGFP作为感兴趣基因的模型，并通过内部核糖体结合位点（IRES）序列（LGIGFP）将LG下游连接起来。为了验证是否可以通过添加HEL来选择性扩增EGFP阳性细胞，我们使用逆转录病毒在IL-3依赖性血细胞BA/F3上共同引入了Hg和LGIGFP。 6-7天后，将IL-3洗涤并去除并在HEL或IL-3补充培养基中选择。 FACS比较了选择前后的EGFP的表达水平和正率，尽管选择前的EGFP阳性率约为1％，但在补充HEL的培养基中观察到生长，而选择后的EGFP阳性率接近100％。另一方面，当在IL-3添加的培养基中培养时，正速率几乎与选择前相同，因此认为基因转染的细胞被从嵌合受体得出的增殖信号选择性扩增。 2。选择性扩增转基因翻译的树突状细胞，以确保靶基因的共表达和嵌合受体，逆转录病毒载体（PMX-HG-I-LG-I-I-EGFP）通过IRES链接Hg，LG和EGFP，其中均与Hg，LG和EGFP相连。首先将该载体引入BA/F3细胞中，并观察到EGFP的表达，并且还证实了HEL浓度依赖性生长，该载体的功能正常。接下来，从小鼠骨髓获得了树突状祖细胞，并通过将IL-6，SIL-6Rα和SCF添加在一起培养，并发现祖细胞可以在未分化的状态下增殖和维持。因此，当使用逆转录病毒将PMX-HG-I-LG-I-EGFP引入树突状祖细胞中时，发现尽管转移效率低为1.1％，但可以转移它。当前，在含有HEL和SCF的培养基中选择转基因树突祖细胞，然后通过FACS随时间测量EGFP阳性细胞速率，并验证了使用此方法的选择性扩增的可行性。

项目成果

Kawahara, M. et al.: "Replacing factor-depenency with that for lysozyme : Affordable culture of IL-6-dependent hybridoma by transfecting artificial cell surface receptor"Biotechnol. Bioeng.. 74. 416-423 (2001)

Kawahara, M. 等人：“用溶菌酶替代因子依赖性：通过转染人工细胞表面受体经济实惠地培养 IL-6 依赖性杂交瘤”Biotechnol。

Kawahara, M. et al.: "A growth signal with an artificially induce erythropoietin receptor-gp130 cytoplasmic domain heterodimer"J. Biochem.. 130. 305-312 (2001)

Kawahara, M. 等人：“人工诱导促红细胞生成素受体 -gp130 胞质结构域异二聚体的生长信号”J.

Kawahara, M. et al.: "Animal cell technology for creation of new era (JAACT 2000)"Kluwer Academic Publishers (in press).

Kawahara, M. 等人：“创造新时代的动物细胞技术 (JAACT 2000)”Kluwer 学术出版社（正在印刷中）。