抗腫瘍活性を高めるエフェクター細胞および樹状細胞の選択的増幅法の開発

开发效应细胞和树突状细胞的选择性扩增方法以增强抗肿瘤活性

• 批准号: 13218031
• 负责人: 長棟 輝行
• 金额: $ 3.14万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13218031/
• 关键词: 樹状細胞; 抗体; 受容体; 遺伝子治療; がん; 選択的増幅

1.抗体/受容体キメラを用いた遺伝子導入細胞の選択的増幅法の開発 本研究ではまず、培養細胞レベルで抗体/受容体キメラを用いた目的遺伝子導入細胞の選択的増幅法を確立することを目指した。エリスロポエチン受容体(EpoR)のリガンド結合ドメインを抗ニワトリ卵白リゾチーム(HEL)抗体HyHEL-10の可変領域VHまたはVLに置換し、細胞内ドメインをIL-6受容体β鎖であるgp130に置換したキメラ受容体(それぞれHg、Lg)発現ベクターを作製した。さらに、目的遺伝子のモデルとして緑色蛍光タンパク質EGFPを選び、Lgの下流に内部リボソーム結合部位(IRES)配列を介して連結した(LgIGFP)。EGFP陽性細胞をHELの添加によって選択的に増幅できるかどうかを検証するために、IL-3依存性血球細胞であるBa/F3に対しレトロウイルスを用いてHgとLgIGFPの同時導入を行った。6〜7日後、IL-3を洗浄除去し、HELまたはIL-3添加培地中で選択した。選択前後におけるEGFPの発現量および陽性率をFACSによって比較した結果、選択前のEGFP陽性率は1%程度であったが、HEL添加培地中で増殖が見られ、選択後のEGFP陽性率はほぼ100%であった。それに対し、IL-3添加培地中で培養した場合は選択前の陽性率とほぼ同等であったことから、キメラ受容体由来の増殖シグナルにより遺伝子導入細胞が選択的に増幅されたと考えられる。2.遺伝子導入樹状細胞の選択的増幅 目的遺伝子とキメラ受容体を確実に同時発現させるために、Hg, LgおよびEGFPをIRESを介してタンデムに連結したレトロウィルスベクター(pMX-Hg-I-Lg-I-EGFP)を作製した。このベクターをまずBa/F3細胞に導入した結果、EGFPの発現が見られ、またHEL濃度依存的に増殖したことから、このベクターが正しく機能することが確認された。次に、マウス骨髄から樹状前駆細胞を得て、IL-6,sIL-6Rα,SCFを併用添加して培養したところ、前駆細胞を未分化状態のまま増殖維持できることが分かった。そこで、樹状前駆細胞にpMX-Hg-I-Lg-I-EGFPをレトロウイルスにより導入したところ、導入効率は1.1%と低かったものの導入できることが分かった。現在、遺伝子導入樹状前駆細胞をHELとSCFを併用添加した培地中で選択しており、経時的にEGFP陽性細胞率をFACSで測定し、本手法を用いた選択的増幅の実現可能性について検証中である。

1.开发使用抗体/受体嵌合体选择性扩增转基因细胞的方法在本研究中，我们将首先建立在培养细胞水平上使用抗体/受体嵌合体选择性扩增转染有靶基因的细胞的方法I。旨在一种嵌合体，其中促红细胞生成素受体（EpoR）的配体结合结构域被抗鸡蛋清溶菌酶（HEL）抗体HyHEL-10的可变区VH或VL取代，胞内结构域被gp130取代，是IL-6受体β链受体（分别为Hg和Lg）表达载体。此外，选择绿色荧光蛋白 EGFP 作为目的基因的模型，并通过内部核糖体结合位点 (IRES) 序列 (LgIGFP) 连接到 Lg 下游。为了验证EGFP阳性细胞是否可以通过添加HEL来选择性扩增，使用逆转录病毒将Hg和LgIGFP同时引入IL-3依赖性血细胞Ba/F3中。 6-7天后，IL-3被洗掉并在HEL或补充有IL-3的培养基中进行选择。通过FACS比较筛选前后EGFP的表达量和阳性率，筛选前的EGFP阳性率约为1%，但在添加HEL的培养基中观察到增殖，筛选后的EGFP阳性率选择率约为1%，为100%。另一方面，当在添加IL-3的培养基中培养时，阳性率几乎与选择前相同，这表明基因转染的细胞被源自嵌合受体的生长信号选择性地扩增。 2.转基因树突状细胞的选择性扩增为了保证目的基因和嵌合受体的同时表达，我们使用逆转录病毒载体（pMX-Hg-I-Lg-I-EGFP）进行制作。当将该载体首次导入Ba/F3细胞时，观察到EGFP的表达，并且细胞以HEL浓度依赖性方式增殖，证实该载体正确发挥作用。接下来，当从小鼠骨髓中获得树突状祖细胞并联合添加IL-6、sIL-6Rα和SCF进行培养时，发现可以将祖细胞维持在未分化状态。因此，当使用逆转录病毒将pMX-Hg-I-Lg-I-EGFP导入树突状祖细胞时，发现虽然导入效率低至1.1％，但导入是可能的。目前，在补充有 HEL 和 SCF 组合的培养基中选择转基因树突状祖细胞，并使用 FACS 随时间测量 EGFP 阳性细胞率，以评估使用该方法选择性扩增的可行性。

项目成果

Kawahara, M. et al.: "Replacing factor-depenency with that for lysozyme : Affordable culture of IL-6-dependent hybridoma by transfecting artificial cell surface receptor"Biotechnol. Bioeng.. 74. 416-423 (2001)

Kawahara, M. 等人：“用溶菌酶替代因子依赖性：通过转染人工细胞表面受体经济实惠地培养 IL-6 依赖性杂交瘤”Biotechnol。

Kawahara, M. et al.: "A growth signal with an artificially induce erythropoietin receptor-gp130 cytoplasmic domain heterodimer"J. Biochem.. 130. 305-312 (2001)

Kawahara, M. 等人：“人工诱导促红细胞生成素受体 -gp130 胞质结构域异二聚体的生长信号”J.

Kawahara, M. et al.: "Animal cell technology for creation of new era (JAACT 2000)"Kluwer Academic Publishers (in press).

Kawahara, M. 等人：“创造新时代的动物细胞技术 (JAACT 2000)”Kluwer 学术出版社（正在印刷中）。