構造、配列、代謝情報を基盤とする抗がん性核酸誘導体の設計

基于结构、序列和代谢信息的抗癌核酸衍生物设计

基本信息

批准号：
12217001
负责人：
松田彰
金额：
$ 27.65万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

CNDACは、その三リン酸体がDNA中に取込まれると、β-脱離反応により一本鎖切断を起こすように分子設計した抗癌性ヌクレオシドである.本研究では、その機序解析を詳細に行い、以下の諸点を明らかにした.1)5種類の血液癌細胞、3種類の固形癌細胞および患者から採取した2種類の繊維芽細胞を用いてG2/M期の割合をCNDAC未処理細胞と処理細胞間で比較したところ、未処理細胞では14〜29%なのに対して処理細胞では33〜55%と有意に増加していた.2)G2期停止に伴って、Chk1のSer-317,Ser-345のリン酸化が起こり、さらにChk1の標的であるCdc25CのSer-216のリン酸化が進行する.その結果、Cdk1のTyr-15がリン酸化されたままになりCyclin B1レベルを上昇させG2期停止に至る.3)CNDAC処理細胞にUCN-01(Chk1阻害剤)を添加すると、G2期細胞の割合が急速に減少し、一時的にG1期細胞が増える.その後、G1期細胞が減少し、アポトーシスが開始される.UCN-01単独ではこのような作用は観察されないので、UCN-01はG2期停止をabrogateし、アポトーシスによる細胞死を大幅に増加させる.4)ML-1細胞をCNDAC処理したところ、二本鎖切断が主に起きていることが明らかになった.この効果もまた、UCN-01添加で増強された.以上のように、CNDACのG2期停止に至る機序の解明とそれに基づくChk1の阻害剤による作用増強が可能になった.がん細胞にX線を照射するとDNAの二本鎖切断を起こすために、G2 checkpoint経路が活性化されG2期で停止し、DNAの修復を待つ.一方、ECydの代謝物であるECyd 5'-三リン酸はRNAポリメラーゼを強力に阻害し、これが引金となりアポトーシスを起こす.この両者を併用した場合に、X-線照射ではヒト胃がん細胞MKN45細胞はネクローシスしか起こさないのに対して、ECydを添加するとアポトーシスへと細胞死の方向を変えることが明らかになった.この機序を明らかにすべく種々検討の結果、ECyd処理により、抗アポトーシス蛋白の一種であり各種がん細胞に高率に発現しているsurvivinがmRNAレベルでも蛋白レベルでも急激に減少することが明らかになった.SurvivinはCdc2-cyclin B1によりリン酸化を受け、M期で抗アポトーシスを発揮しているが、ECyd処理によりsurvivinが合成されなくなったためG2 checkpointが解除され、caspase依存的なアポトーシスが誘導されたと考えられる.

CNDAC是一种抗癌核苷，经过分子设计，当其三磷酸形式掺入DNA时，可通过β-消除反应引起单链断裂。在本研究中，我们将分析该机制，并进行了详细研究并阐明了以下内容。要点： 1)使用从患者收集的5种血癌细胞、3种实体瘤细胞和2种成纤维细胞，我们确定了G2/M期未经CNDAC处理的细胞和处理过的细胞的比例。当在细胞之间进行比较时，增加量显着增加，从未处理细胞中的 14% 至 29% 增加到处理细胞中的 33% 至 55%。2) 随着 G2 期停滞，Chk1 Ser-317、Ser-34 5 发生磷酸化，Chk1 的靶点 Cdc25C 的 Ser-216 进一步磷酸化。结果，Cdk1 的 Tyr-15 保持磷酸化状态，Cyclin增加 B1 水平，导致 G2 期停滞 3) CNDAC 处理的细胞中添加 UCN-01（Chk1 抑制剂）会迅速降低 G2 期细胞的比例，并暂时增加 G1 期细胞，然后 G1 期细胞减少。由于单独使用 UCN-01 没有观察到这种作用，因此 UCN-01 消除了 G2 期停滞并诱导细胞凋亡。 4)当用CNDAC处理ML-1细胞时，发现主要发生双链断裂，这种效果也通过添加UCN-01而增强，如上所述，已经可以阐明其机制。导致 CNDAC 的 G2 期停滞，并通过基于此机制的 Chk1 抑制剂增强其效果。用 X 射线照射癌细胞会导致 DNA 双链断裂。检查点通路被激活并在G2期停止，等待DNA修复。另一方面，ECyd，ECyd的代谢产物， 5'-三磷酸强烈抑制 RNA 聚合酶，从而引发细胞凋亡。当两者一起使用时，人胃癌 MKN45 细胞仅在暴露于 X 射线时才会发生坏死。很明显，ECyd 的添加会改变细胞死亡的方向。。为了阐明这一机制，我们进行了多项研究，结果发现，ECyd 治疗可在 mRNA 和蛋白质水平上抑制存活蛋白（一种在多种癌细胞中高表达的抗凋亡蛋白），并发现存活蛋白迅速降低。 .Survivin 是 Cdc2-cyclin它被 B1 磷酸化，并在 M 期表现出抗凋亡特性，但 ECyd 治疗会阻止生存素合成，从而释放 G2 检查点并诱导 caspase 依赖性细胞凋亡。