構造、配列、代謝情報を基盤とする抗がん性核酸誘導体の設計

基于结构、序列和代谢信息的抗癌核酸衍生物设计

基本信息

批准号：
12217001
负责人：
松田彰
金额：
$ 27.65万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

CNDACは、その三リン酸体がDNA中に取込まれると、β-脱離反応により一本鎖切断を起こすように分子設計した抗癌性ヌクレオシドである.本研究では、その機序解析を詳細に行い、以下の諸点を明らかにした.1)5種類の血液癌細胞、3種類の固形癌細胞および患者から採取した2種類の繊維芽細胞を用いてG2/M期の割合をCNDAC未処理細胞と処理細胞間で比較したところ、未処理細胞では14〜29%なのに対して処理細胞では33〜55%と有意に増加していた.2)G2期停止に伴って、Chk1のSer-317,Ser-345のリン酸化が起こり、さらにChk1の標的であるCdc25CのSer-216のリン酸化が進行する.その結果、Cdk1のTyr-15がリン酸化されたままになりCyclin B1レベルを上昇させG2期停止に至る.3)CNDAC処理細胞にUCN-01(Chk1阻害剤)を添加すると、G2期細胞の割合が急速に減少し、一時的にG1期細胞が増える.その後、G1期細胞が減少し、アポトーシスが開始される.UCN-01単独ではこのような作用は観察されないので、UCN-01はG2期停止をabrogateし、アポトーシスによる細胞死を大幅に増加させる.4)ML-1細胞をCNDAC処理したところ、二本鎖切断が主に起きていることが明らかになった.この効果もまた、UCN-01添加で増強された.以上のように、CNDACのG2期停止に至る機序の解明とそれに基づくChk1の阻害剤による作用増強が可能になった.がん細胞にX線を照射するとDNAの二本鎖切断を起こすために、G2 checkpoint経路が活性化されG2期で停止し、DNAの修復を待つ.一方、ECydの代謝物であるECyd 5'-三リン酸はRNAポリメラーゼを強力に阻害し、これが引金となりアポトーシスを起こす.この両者を併用した場合に、X-線照射ではヒト胃がん細胞MKN45細胞はネクローシスしか起こさないのに対して、ECydを添加するとアポトーシスへと細胞死の方向を変えることが明らかになった.この機序を明らかにすべく種々検討の結果、ECyd処理により、抗アポトーシス蛋白の一種であり各種がん細胞に高率に発現しているsurvivinがmRNAレベルでも蛋白レベルでも急激に減少することが明らかになった.SurvivinはCdc2-cyclin B1によりリン酸化を受け、M期で抗アポトーシスを発揮しているが、ECyd処理によりsurvivinが合成されなくなったためG2 checkpointが解除され、caspase依存的なアポトーシスが誘導されたと考えられる.

CNDAC是一种抗癌核苷，在将三磷酸掺入DNA中时，其分子设计可引起单链断裂。在这项研究中，使用五种血液学癌细胞，三种类型的固体癌细胞以及两种类型的成纤维细胞，比较了CNDAC未经治疗和处理过的细胞之间的G2/M相比进行了详细进行的机制分析：1）G2/M相比进行了比较。未经治疗和处理的细胞在未经处理的细胞中显示出14-29％的显着增加，而处理的细胞为33-55％。 2）作为G2停滞，CHK1磷酸化的Ser-317和Ser-345发生，CDC25C（CHK1的靶标）的Ser-216的CHK1靶磷酸化。结果，CDK1中的Tyr-15保持磷酸化，细胞周期蛋白增加了B1水平并导致G2相阻滞。3）在CNDAC处理的细胞中添加UCN-01（CHK1抑制剂）迅速降低G2相细胞的比例，并暂时增加G1相细胞的数量。之后，G1相细胞降低，凋亡开始。由于单独使用UCN-01观察到这种效果，因此UCN-01消除了G2相阻滞，导致凋亡。 4）ML-1细胞的CNDAC治疗显示，双链断裂主要发生。通过添加UCN-01，还可以增强这种效果。如上所述，可以阐明导致CNDAC停滞和CHK1抑制剂作用的机制。为了在用X射线照射癌细胞时引起DNA的双链断裂，G2是G2链断裂的结果。检查点途径被激活并在G2阶段停止，等待DNA修复。同时，ECYD 5'-三磷酸酯是ECYD的代谢产物，强烈抑制RNA聚合酶，从而触发凋亡。当两者结合使用时，发现当X射线照射仅引起坏死时，人类胃癌细胞MKN45细胞会发生坏死，而ECYD则增加了将细胞死亡方向转化为细胞凋亡的方向。各种研究表明，eCyd治疗表明，一种抗凋亡蛋白的Survivin，在各种癌细胞中高度表达，在mRNA和蛋白质水平下迅速降低。 Survivin是Cdc2-cyclin，它被B1磷酸化并在M期施加抗凋亡，但是ECYD处理可防止属于Survivin的合成，因此G2检查点被取消，并可能诱发caspase依赖性凋亡。