アデノウイルスE1A誘導アポトーシスにおけるトポイソメラーゼIIα特異的分解機構

腺病毒E1A诱导细胞凋亡中拓扑异构酶IIα特异性降解机制

基本信息

批准号：
09267237
负责人：
中島琢磨
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Tokyo University of Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09267237/
关键词：
癌遺伝子アデノウイルス E1A トポイソメラーゼIIα アポトーシス細胞周期

项目摘要

1 E1A誘導アポトーシスの過程で活性化し、トポイソメラーゼ(Topo)IIαを標的とするユビキチン(Ub)結合酵素の精製を行なった。デキサメタゾン(dex)投与によりE1Aの発現を誘導42時間後のMA1細胞のS100抽出液(の活性が最も高い)を出発材料とし、Ubアフィニティカラムに結合しResource-Qカラムに結合しない画分を回収後、Ub結合活性を持つ分子量約20kDaの蛋白をSDS-PAGEにより単離した(論文1)。2 単離した約20kDaのUb結合酵素は、アミノ酸配列を決定した結果UbcH7であることが分った。UbcH7のin vivoにおける機能は不明であるが、マウスのホモログUbcM4の欠失がembryonic lethalとなることから、細胞分化・増殖の制御に必須のUb結合酵素と推定される。TopoIIαの発現が細胞周期依存的に厳密な調節を受けていることから、UbcH7がE1A誘導アポトーシスの過程と細胞周期におけるTopoIIαのUb化に関与している可能性が高い。3 UbcH7に特徴的なアミノ酸配列を持つオリゴペプチドを合成し、このペプチドに反応する抗血清を調製中ある。また、UbcH7のcDNAにヒト細胞で強力に発現するβアクチンプロモーターを付加し、発現プラスミドを構築した。このプラスミドの導入により、ヒト細胞がどのような変化を起こすか、また、被導入細胞内のTopoIIαレベルがどのように変化するかを解析中である。

1激活了E1A诱导的凋亡过程，并进行了由IIα，拓扑异构酶（TOPO）IIα靶向的泛素（UB）结合酶的细化。 E1a的表达用作MA1细胞S100提取（MA1细胞的最高活性）的出发材料（DEX）给药（DEX），即E1A诱导后42小时，并绑定了UB亲和力列并收集未键入资源Q列的馏分，通过SDS-PAGE分离出具有约20 kDa的分子量约20 kDa的蛋白质（纸1）。由于确定氨基酸序列，确定了约20kDa的两个分离的UB结合酶为UBCH7。尽管ubCH7在体内的功能尚不清楚，但由于ubcm4的缺失变成了包含的lethhal，因此估计是一种对控制细胞分化和生长的必不可少的UB结合酶。由于在细胞周期依赖性中严格调整了topoiiα的表达，因此在E1A诱导凋亡和细胞周期中，UBCH7很有可能参与TOPOOIIα的Ub。 3 UBCH7的寡肽具有具有特征性的氨基酸序列，并制备了对该肽反应的抗抑制剂。另外，将表达质粒添加到UBCH7 cDNA中，该cDNA在人类细胞中强烈表达。该质粒的引入是在分析改变人类细胞的变化以及引入细胞中拓扑IIα水平的水平如何变化。