分泌蛋白質の品質管理機構としての小胞体内蛋白分解メカニズムの解析

内质网蛋白降解机制作为分泌蛋白质量控制机制的分析

基本信息

批准号：
09267232
负责人：
小出武比古
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Himeji Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

新規に合成された分泌タンパク質のうち、遺伝的変異、サブユニットの会合異常、あるいは薬物誘導などが原因で、新生ペプチド鎖が不適切にフォールディングされるものは、分泌経路から除外され、小胞体内で速やかに分解されることが知られている。この現象は、小胞体における「新生タンパク質品質管理機構」と呼ばれ、近年特に注目されている。昨年までの本重点領域研究でこの小胞体内での異常タンパク質の選択的分解には、プロテアソーム様酵素が関与されていることを明らかにした。そこで、本年度は、(1)小胞体プロテアソーム様酵素の精製と性状解析を行うと共に、(2)遺伝的変異が原因で分泌異常となったアンチトロンビン変異体とヒスチジンリッチ糖タンパク質Tokushimaを哺乳類培養細胞中に発現し、その細胞内分解を解析した。(1)小胞体プロテアソーム様酵素の精製と性状解析--ラット肝ミクロソーム画分から、分子量約60万で、SDS-PAGE上では、細胞質プロテアソームと同じサブユニットパターンを示すプロテアソーム様酵素(R2プロテアーゼと仮命名)の単離に成功した。本酵素と細胞質プロテアソームの諸性質を比較したところ、塩濃度感受性や至適pH、さらにカゼインを基質として用いた場合の分解パターンや二次元ゲル電気泳動によるサブユニットパターンの比較などに若干の差異が認められたので、今後さらに検討する。(2)アンチトロンビンおよびヒスチジンリッチ糖タンパク質(HRG)変異体の細胞内分解の解析--アンチトロンビン欠乏症の原因となったGlu313欠失変異体(ΔGlu313)およびPro429が停止コドンとなった変異体(P→stop)をそれぞれBHK細胞に発現させ、各々の細胞内動態を解析した。その結果、両変異体ともほぼ正常に生合成されるものの、細胞外への分泌は野生型に比して5%以下であり、細胞内での分解が示唆された。さらに、各種プロテアーゼインヒビターによる分解阻止効果を調べた結果では、いずれの変異体も、LLL(carbobenzoxy-leucyl-leucyl-leucinal),LLnV(carbobenzoxy-leucyl-leucyl-norvalinal)およびlactacystinなどのプロテアソームインヒビターによって分解が強く阻止されたことから、プロテアソームによる分解が示唆された。また、HRG欠乏症の原因となったGly85Glu置換体(HRG-徳島と命名)をBHK細胞に発現し、細胞内分解を確認した。

在新合成的分泌的蛋白质中，由于遗传突变，异常的亚基或药物诱导的异常关联而被折叠的新生肽链的蛋白质被折叠，已知被排除在分泌途径之外并在内质网中迅速降解。这种现象被称为内质网中的“鼻形蛋白质质量控制机制”，近年来一直引起人们的特别关注。直到去年，这项重点的地区研究表明，蛋白酶体样酶参与内质网中异常蛋白质的选择性降解。因此，今年，（1）进行内质网蛋白酶体样酶的纯化和表征，以及（2）（2）抗凝血酶突变体和富含组氨酸的糖蛋白toushima在遗传突变中被异常分泌的抗糖蛋白tokhima在遗传突变中被分泌，在哺乳动物培养的细胞和内部培养细胞中表达。（1）从大鼠肝脏微粒体分数中纯化和表征内质网的蛋白酶体样酶，在SDS-PAGE上成功分离了大约600,000个分子量，该分子量是在SDS-PAGE上分离出来的，SDS-PAGE是一种类似于proteasome的酶（一种表现为pynypomepome酶），表现出相同的亚果层蛋白酶蛋白酶的蛋白酶。当比较该酶和细胞质蛋白酶体的性质时，盐浓度敏感性，最佳pH值和降解模式的差异很小，当酪蛋白用作底物，以及通过二维凝胶电泳的亚基模式，因此将在将来进一步考虑。 (2) Analysis of intracellular degradation of antithrombin and histidine-rich glycoprotein (HRG) mutants--The Glu313 deletion mutants (ΔGlu313) that caused antithrombin deficiency and the mutants (P→stop) that had the pro-429-produced the intracellular kinetics in BHK cells, respectively.结果，尽管几乎正常地将两个突变体的生物合成，但与野生型相比，细胞外分泌少于5％，这表明它们在细胞内降解。 Furthermore, the results of examining the degradation inhibitors of various protease inhibitors showed that degradation of both mutants was strongly blocked by proteasome inhibitors such as LLL (carbobenzoxy-leucyl-leucyl-leucyl-leucinal), LLnV (carbobenzoxy-leucyl-leucyl-norvalinal), and lactacystin, suggesting that实现了蛋白酶体的降解。此外，在BHK细胞中表达了引起HRG缺乏的Gly85Glu取代（称为HRG-Tokushima），并确认了细胞内降解。