分泌蛋白質の品質管理機構としての小胞体内蛋白分解メカニズムの解析

内质网蛋白降解机制作为分泌蛋白质量控制机制的分析

基本信息

批准号：
09267232
负责人：
小出武比古
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Himeji Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

新規に合成された分泌タンパク質のうち、遺伝的変異、サブユニットの会合異常、あるいは薬物誘導などが原因で、新生ペプチド鎖が不適切にフォールディングされるものは、分泌経路から除外され、小胞体内で速やかに分解されることが知られている。この現象は、小胞体における「新生タンパク質品質管理機構」と呼ばれ、近年特に注目されている。昨年までの本重点領域研究でこの小胞体内での異常タンパク質の選択的分解には、プロテアソーム様酵素が関与されていることを明らかにした。そこで、本年度は、(1)小胞体プロテアソーム様酵素の精製と性状解析を行うと共に、(2)遺伝的変異が原因で分泌異常となったアンチトロンビン変異体とヒスチジンリッチ糖タンパク質Tokushimaを哺乳類培養細胞中に発現し、その細胞内分解を解析した。(1)小胞体プロテアソーム様酵素の精製と性状解析--ラット肝ミクロソーム画分から、分子量約60万で、SDS-PAGE上では、細胞質プロテアソームと同じサブユニットパターンを示すプロテアソーム様酵素(R2プロテアーゼと仮命名)の単離に成功した。本酵素と細胞質プロテアソームの諸性質を比較したところ、塩濃度感受性や至適pH、さらにカゼインを基質として用いた場合の分解パターンや二次元ゲル電気泳動によるサブユニットパターンの比較などに若干の差異が認められたので、今後さらに検討する。(2)アンチトロンビンおよびヒスチジンリッチ糖タンパク質(HRG)変異体の細胞内分解の解析--アンチトロンビン欠乏症の原因となったGlu313欠失変異体(ΔGlu313)およびPro429が停止コドンとなった変異体(P→stop)をそれぞれBHK細胞に発現させ、各々の細胞内動態を解析した。その結果、両変異体ともほぼ正常に生合成されるものの、細胞外への分泌は野生型に比して5%以下であり、細胞内での分解が示唆された。さらに、各種プロテアーゼインヒビターによる分解阻止効果を調べた結果では、いずれの変異体も、LLL(carbobenzoxy-leucyl-leucyl-leucinal),LLnV(carbobenzoxy-leucyl-leucyl-norvalinal)およびlactacystinなどのプロテアソームインヒビターによって分解が強く阻止されたことから、プロテアソームによる分解が示唆された。また、HRG欠乏症の原因となったGly85Glu置換体(HRG-徳島と命名)をBHK細胞に発現し、細胞内分解を確認した。

在新合成的分泌蛋白中，由于基因突变、异常亚基关联或药物诱导而导致新生肽链不正确折叠的蛋白被排除在分泌途径之外并储存在内质网中，已知其会被迅速分解。这种现象被称为内质网中的“新生蛋白质质量控制机制”，近年来受到特别关注。直到去年我们在这一优先领域的研究表明，类蛋白酶体酶参与内质网内异常蛋白质的选择性降解。因此，今年，我们将（1）纯化和表征内质网蛋白酶体样酶，以及（2）研究培养的哺乳动物细胞中因基因突变而分泌异常的抗凝血酶突变体和富含组氨酸的糖蛋白德岛。它的细胞内降解。 (1) 内质网蛋白酶体样酶的纯化和表征 - 提取分子量约为 600,000 且在 SDS-PAGE 上显示与细胞质蛋白酶体相同的亚基模式的蛋白酶体样酶（假设鉴定为 R2 蛋白酶）从大鼠肝微粒体部分（命名）中成功分离。当我们比较该酶和细胞质蛋白酶体的特性时，我们发现在盐浓度敏感性、最适pH、以酪蛋白为底物时的降解模式以及通过二维凝胶电泳比较亚基模式方面存在一些差异。已获批准，我们将在未来进一步考虑。 (2)抗凝血酶和富含组氨酸的糖蛋白(HRG)突变体的细胞内降解分析——在BHK细胞中表达导致抗凝血酶缺陷的Glu313缺失突变体(ΔGlu313)和以Pro429为终止密码子(P→stop)的突变体，并分析了它们的细胞内动力学。结果，两种突变体几乎都能正常生物合成，但与野生型相比，向细胞外的分泌量低于5%，表明它们在细胞内被降解。此外，研究各种蛋白酶抑制剂抑制降解效果的结果表明，所有突变体均被LLL（苯甲氧基-亮氨酰-亮氨酰-亮氨醛）、LLnV（苯苯甲氧基-亮氨酰-亮氨酰-正缬醛）和乳胞素等蛋白酶体抑制剂降解。被强烈抑制，表明它被蛋白酶体降解。此外，我们在BHK细胞中表达了导致HRG缺陷的Gly85Glu取代产物（命名为HRG-Tokushima），并证实了其细胞内降解。