分泌蛋白質の品質管理機構としての小胞体内蛋白分解メカニズムの解析

内质网蛋白降解机制作为分泌蛋白质量控制机制的分析

基本信息

批准号：
08278231
负责人：
小出武比古
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Himeji Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

分泌蛋白質の品質管理機構として、構造異常蛋白質が分泌されず、小胞体内で分解されることが知られている。本研究は、薬物ワルファリンの存在下で生合成された血液凝固制御因子プロテインC (PC)の細胞内での特異的分解を詳細に解析しようとするものであり、本年は、PC発現BHK細胞を用いて細胞内の分子シャペロンとの会合と各種阻害剤の影響を調べた。[方法と結果]1.架橋剤DSPで架橋後、エンドグレコシダーゼHで消化し、SDS-PAGEを行ったところ、100kDaと80kDaの蛋白(それぞれGRP94、GRP78)に加え、60kDaのエンドH非感受性の蛋白が検出されたが、この蛋白質はWestern blotによりカルレティキュリンであることが同定できた。2.膜結合性の分子シャペロンであるカルネキシンは、ビタミンK下、ワルファリン下、いずれのPCとも一過性に会合した。3.各種プロテアーゼ阻害剤をチェイス時に添加するとE64 (d)などER60プロテアーゼをin vitroで阻害するシステインプロテアーゼ阻害剤では、PCの分割は阻止されなかったが、プロテアソームの合成阻害剤であるZ-Leu-Leu-Leu-H、Z-Leu-Leu-Nva-H、Z-Ile-Glu (O-t-Bu) -Ala-Leu-Hによって強い分解阻害が見られ、プロテアソームの特異的阻害剤であるラクタシスチンはワルファリン下のPC分解を完全に阻止した。[結論]ワァルファリンのためにγ-カルボキシル化を受けないPIVKA-PCには、HSP系シャペロン(GRP94、GRP78)の他に、Ca^<2+>-依存性シャペロン(カルレティキュリンとカルネキシン)が会合する。阻害のスペクトラムから分解を司るプロテアーゼとしてはプロテアソームが有力であり、分泌タンパクであるPCが小胞体から細胞質内に輸送された後に分解される可能性がある。

众所周知，结构异常蛋白质不分泌，并且在内质网中降解，作为分泌蛋白的质量控制机制。这项研究旨在分析在药物华法林存在下进行的血液凝结调节蛋白C（PC）生物合成的细胞内特异性降解，今年我们研究了与细胞内分子伴侣蛋白的关联，并使用PC表达BHK细胞的各种抑制剂的作用。 [方法和结果] 1。与交联DSP进行交联后，用内粒糖苷酶H消化蛋白质，并进行SDS-PAGE。除了100 kDa和80 kDa的蛋白质（分别为GRP94和GRP78）外，还检测到60 kDa内h不敏感的蛋白质，并确定蛋白质印迹为钙网蛋白。 2。钙粘蛋白是一种膜结合的分子伴侣，在维生素K和华法林下瞬时与这两个PC相关。 3. Cysteine protease inhibitors that inhibit ER60 proteases such as E64 (d) in vitro when various protease inhibitors were added during chase, did not block PC resolution, but strong degradation inhibition was observed by Z-Leu-Leu-Leu-H, Z-Leu-Leu-Nva-H, and Z-Ile-Glu (O-t-Bu)-Ala-Leu-H, and乳酸化，是蛋白酶体的特定抑制剂，在华法林下完全阻断了PC降解。 [结论]除了基于HSP的伴侣（GRP94，GRP78），Ca^<2+> - 依赖性伴侣（钙网蛋白和钙网蛋白）与PIVKA-PC相关，而PIVKA-PC不受varfarlin造成的γ-羧化。蛋白酶体是控制从抑制性谱中降解的最可能的蛋白酶，并且有可能将分泌蛋白的PC从内质网传输到细胞质中。