分泌蛋白質の品質管理機構としての小胞体内蛋白分解メカニズムの解析

内质网蛋白降解机制作为分泌蛋白质量控制机制的分析

基本信息

批准号：
08278231
负责人：
小出武比古
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Himeji Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

分泌蛋白質の品質管理機構として、構造異常蛋白質が分泌されず、小胞体内で分解されることが知られている。本研究は、薬物ワルファリンの存在下で生合成された血液凝固制御因子プロテインC (PC)の細胞内での特異的分解を詳細に解析しようとするものであり、本年は、PC発現BHK細胞を用いて細胞内の分子シャペロンとの会合と各種阻害剤の影響を調べた。[方法と結果]1.架橋剤DSPで架橋後、エンドグレコシダーゼHで消化し、SDS-PAGEを行ったところ、100kDaと80kDaの蛋白(それぞれGRP94、GRP78)に加え、60kDaのエンドH非感受性の蛋白が検出されたが、この蛋白質はWestern blotによりカルレティキュリンであることが同定できた。2.膜結合性の分子シャペロンであるカルネキシンは、ビタミンK下、ワルファリン下、いずれのPCとも一過性に会合した。3.各種プロテアーゼ阻害剤をチェイス時に添加するとE64 (d)などER60プロテアーゼをin vitroで阻害するシステインプロテアーゼ阻害剤では、PCの分割は阻止されなかったが、プロテアソームの合成阻害剤であるZ-Leu-Leu-Leu-H、Z-Leu-Leu-Nva-H、Z-Ile-Glu (O-t-Bu) -Ala-Leu-Hによって強い分解阻害が見られ、プロテアソームの特異的阻害剤であるラクタシスチンはワルファリン下のPC分解を完全に阻止した。[結論]ワァルファリンのためにγ-カルボキシル化を受けないPIVKA-PCには、HSP系シャペロン(GRP94、GRP78)の他に、Ca^<2+>-依存性シャペロン(カルレティキュリンとカルネキシン)が会合する。阻害のスペクトラムから分解を司るプロテアーゼとしてはプロテアソームが有力であり、分泌タンパクであるPCが小胞体から細胞質内に輸送された後に分解される可能性がある。

众所周知，结构异常的蛋白质不会在内质网内分泌和降解，作为分泌蛋白质的质量控制机制。本研究旨在详细分析凝血调节蛋白 C (PC) 的细胞内特异性降解，该蛋白是在药物华法林存在下生物合成的，并使用细胞内分子伴侣和各种抑制剂的作用进行了研究。 [方法与结果] 1.用交联剂DSP交联后，用内切糖苷酶H消化和SDS-PAGE显示，除了100 kDa和80 kDa的蛋白质（分别为GRP94和GRP78）外，还有60 kDa的内切H检测到不敏感蛋白，通过Western blot鉴定该蛋白为钙网蛋白。 2. Calnexin，一种膜结合分子伴侣，在维生素 K 和华法林条件下与 PC 短暂相关。 3.当追逐时添加各种蛋白酶抑制剂时，半胱氨酸蛋白酶抑制剂如体外抑制ER60蛋白酶的E64(d)并不能阻止PC分裂，但蛋白酶体合成抑制剂Z-Leu，-Leu-Leu -H、Z-Leu-Leu-Nva-H、Z-Ile-Glu (O-t-Bu) -Ala-Leu-H 观察到对 PC 降解的强烈抑制，而蛋白酶体的特异性抑制剂乳胞素在华法林作用下完全阻止了 PC 降解。 [结论]PIVKA-PC不会因华法林而发生γ-羧化，不仅含有基于HSP的分子伴侣(GRP94和GRP78)，而且含有Ca^2+依赖性分子伴侣(钙网蛋白和钙联蛋白)。由于其抑制谱，蛋白酶体很可能是负责降解的蛋白酶，PC这种分泌蛋白也有可能从内质网转运到细胞质后被降解。