分泌蛋白質の品質管理機構としての小胞体内蛋白分解メカニズムの解析

内质网蛋白降解机制作为分泌蛋白质量控制机制的分析

基本信息

批准号：
10163237
负责人：
小出武比古
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Himeji Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10163237/
关键词：
品質管理機構小胞体 20Sプロテアソーム小胞体プロテアソーム

项目摘要

小胞体(ER)に局在し、新生タンパク質の品質管理機構に関与する可能性のあるプロテアーゼを単離することを目的として、ラット肝ミクロソーム画分の0.0125%および2.5%コール酸ナトリウム可溶化画分より、合成基質Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA(LLVY)水解活性を指標として、R2プロテアーゼ(R2)およびDE3プロテアーゼ(DE3)を精製した。両プロテアーゼ共に、SDS-PAGE上では、20Sプロテアソーム(20S)のパターンときわめて類似する多数のサブユニットが検出された。しかし、2次元PAGEでは、3者のサブユニットのスポットの一部に相違が認められた。次に、両プロテアーゼの酵素化学的性質を細胞質20Sプロテアソーム(20S)との比較で検討した。各種の合成ぺプチド基質を用いて検討した結果、R2とDE3は20Sと同様の基質特異性を有していた。20Sに特徴的なSDSによるLLVY水解活性の増強については、R2とDE3は増強の程度が20Sのそれよりも強いことが認められ、ER膜のリン脂質組成を模倣したリン脂質混合物存在下でもR2、DE3のLLVY水解活性が20Sのそれよりも上昇した。また、検討した4種の合成基質の水解活性すべてにおいて、R2とDE3はプロテアソームの特異的阻害剤に対して20Sと同様の阻害剤感受性を示したが、TPCKやキモスタチンに対しては特定の合成基質の水解活性の阻害で若干の相違も認められた。しかし一方で、TPCKはBoc-Leu-Arg-Arg-MCA水解活性を増強するという興味深い現象が認められ、この場合の活性化倍率は、20SがR2、DE3よりも高かった。タンパク質基質を用いた検討では、R2とDE3は20Sと同様にintactなBSAやリゾチームはほとんど分解しなかったが、DE3は、一定の3次元構造を持たないといわれているβ-カゼインをよく分解した。また、還元カルボキシメチル化リゾチーム(RCM-Lz)に対しては、DE3は20Sよりはるかに分解活性が高く、これらプロテアーゼ間のタンパク質分解特性に差異が認められた。このように、R2とDE3は20Sと局在部位が異なることに加えて、酵素化学的特性においても幾つかの点で異なることが明らかとなった。

大鼠肝微粒体组分中含有 0.0125% 和 2.5% 胆酸钠，目的是分离位于内质网 (ER) 中并可能参与新生蛋白质质量控制机制的蛋白酶。使用合成底物 Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA (LLVY) 水解活性作为指标，从 LiM 溶解级分中纯化 R2 蛋白酶 (R2) 和 DE3 蛋白酶 (DE3)。对于这两种蛋白酶，在 SDS-PAGE 上检测到许多亚基，这些亚基与 20S 蛋白酶体 (20S) 的模式非常相似。然而，在二维PAGE中，在三个亚基的一些斑点中观察到差异。接下来，研究了两种蛋白酶的酶化学性质，并与细胞质 20S 蛋白酶体 (20S) 进行比较。使用各种合成肽底物进行研究的结果是，R2和DE3具有与20S相同的底物特异性。关于 SDS 对 LLVY 水解活性的增强（这是 20S 的特征），观察到 R2 和 DE3 的增强程度比 20S 更强，甚至在存在模拟 20S 磷脂组成的磷脂混合物的情况下也是如此。 ER膜、R2和DE3，DE3的LLVY水解活性较20S有所提高。此外，在所检测的四种合成底物的所有水解活性中，R2和DE3对蛋白酶体特异性抑制剂表现出与20S相同的抑制剂敏感性，但在底物水解活性的抑制方面也观察到了一些差异。然而，另一方面，观察到一个有趣的现象，即TPCK增强了Boc-Leu-Arg-Arg-MCA水解活性，在这种情况下，20S的激活倍数高于R2和DE3。在使用蛋白质底物的研究中，R2 和 DE3 与 20S 一样，几乎不能降解完整的 BSA 或溶菌酶，但 DE3 可以很好地降解 β-酪蛋白，据说β-酪蛋白没有固定的三维结构。此外，DE3 对还原型羧甲基化溶菌酶 (RCM-Lz) 的降解活性比 20S 高得多，表明这些蛋白酶之间的蛋白水解特性存在差异。通过这种方式，揭示了 R2 和 DE3 与 20S 的不同之处在于其定位位点以及其酶化学性质的多个方面。