色素性乾皮症蛋白質の無細胞DNA除去修復系および転写系における役割

着色性干皮病蛋白在无细胞 DNA 切除修复和转录系统中的作用

基本信息

批准号：
08264221
负责人：
益谷央豪
金额：
$ 2.88万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08264221/
关键词：
ヌクレオチド除去修復色素性乾皮症 XPC HHR23B HHR23A TFIIH

项目摘要

1)XP-C群細胞抽出液を分画・再構成し、XPC、HHR23B、HHR23Aの3者を、全て含まない無細胞NER系を構築した。この系では、XPC単独では低いNER活性しか示さず、HHR23Bの共存下で、XPCのNER活性が促進された。また、HHR23Bのかわりに、HHR23Aを加えても同様の効果を示した。これらのことから、XPCばかりでなくHHR23BもNERに関与していること、また、HHR23BとHHR23Aは機能的に互換性のある蛋白質であることが示された。2)HeLa細胞より精製したXPC-HHR23B複合体は、一本鎖DNAセルロースカラムに非常に強く結合したことから、DNA結合活性を持つことが示唆された。そこで、ゲルシフト法を用いて、そのDNA結合活性について検討した。XPC-HHR23B複合体は、一本鎖および二本鎖のDNAにともに結合したが、二本鎖DNAにより強く結合した。また、紫外線を照射したDNAにより高い親和性を示したことから、DNA損傷の認識に関与していることが示唆された。3)基本転写因子TFIIHの構成成分の一つであるp62に特異的な抗体を用いて、免疫沈降を行ったところ、ヒトのNERの正常な細胞の抽出液中よりTFIIHとともにXPCが共沈降した。精製したTFIIHとXPC-HHR23Bを用いた実験においても、抗p62抗体によりTFIIHとともにXPC-HHR23Bが共沈降した。さらに、GSTとの融合蛋白質として発現・精製したGST-HHR23Bを用いて、TFIIHとの結合について検討した結果、GST-HHR23BとTFIIHの結合は検出されなかったが、XPCの共存下では、TFIIHがGST-HHR23BおよびXPCとともに共沈降した。これらのことから、TFIIHとXPCが直接相互作用していることが示された。

1)我们对XP-C组细胞提取物进行分级和重构，构建不含XPC、HHR23B和HHR23A全部三种的无细胞NER系统。在该系统中，单独的XPC表现出较低的NER活性，而与HHR23B共存时XPC的NER活性得到促进。此外，当添加HHR23A代替HHR23B时显示出相同的效果。这些结果表明，不仅XPC而且HHR23B也参与NER，并且HHR23B和HHR23A是功能相容的蛋白质。 2) 从 HeLa 细胞中纯化的 XPC-HHR23B 复合物与单链 DNA 纤维素柱的结合非常牢固，表明它具有 DNA 结合活性。因此，我们使用凝胶迁移方法研究了其 DNA 结合活性。 XPC-HHR23B 复合物可结合单链和双链 DNA，但与双链 DNA 的结合更牢固。此外，它对暴露在紫外线下的DNA表现出更高的亲和力，表明它参与了DNA损伤的识别。 3)当使用p62特异性抗体进行免疫沉淀时，p62是基本转录因子TFIIH的成分之一，在正常人NER细胞的提取物中XPC与TFIIH共沉淀。在使用纯化的 TFIIH 和 XPC-HHR23B 的实验中，XPC-HHR23B 通过抗 p62 抗体与 TFIIH 共沉淀。此外，使用作为与GST的融合蛋白表达和纯化的GST-HHR23B检查与TFIIH的结合，结果没有检测到GST-HHR23B和TFIIH之间的结合，但是在XPC的共存中，TFIIH与GST-共沉淀。 HHR23B 和 XPC。这些结果表明 TFIIH 和 XPC 直接相互作用。