ヌクレオチド除去修復による遺伝情報維持と細胞機能制御機構

核苷酸切除修复的遗传信息维持和细胞功能控制机制

基本信息

批准号：
12143207
负责人：
菅澤薫
金额：
$ 22.53万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞の紫外線照射に伴い、C群色素性乾皮症(XPC)タンパク質がUV-DDB依存的にユビキチン化されることを昨年までに明らかにした。細胞抽出液からの共免疫沈降実験、および精製タンパク質を用いたin vitroでの結合実験から、XPCとUV-DDBが直接物理的に相互作用することが示された。また、DDB1、DDB2に加えてcullin 4A、Roc1を昆虫細胞で同時に発現させることにより、ユビキチン・リガーゼ活性を持つUV-DDB-E3複合体を精製し、これを用いてXPCのユビキチン化反応を無細胞系で再構成することに成功した。この反応系ではXPCだけでなく、DDB2とcullin 4Aもユビキチン化の基質となるが、紫外線照射した細胞ではXPCのユビキチン化が可逆的であるのに対して、DDB2は速やかに分解されることがわかった。すなわち、XPCとDDB2は共通のE3によってユビキチン化されるにもかかわらず、その細胞内での運命が大きく異なることが明らかになった。一方、XPCと複合体を形成するcentrin 2の機能を解析するため、まずXPCにおけるcebtrin 2結合領域を同定した。この結合領域に3か所のアミノ酸置換を導入することによってcentrin 2との結合能を欠く変異XPCを作成した。この変異XPCは細胞内、および無細胞系において、野生型XPCと比較してヌクレオチド除去修復における活性が有意に低下していた。精製タンパク質を用いた生化学的な解析により、centrin 2は複合体形成を介してXPCの損傷DNA結合活性を増強し、それによって修復反応を促進することが示された。

去年，我们发现 C 组色素性干皮病 (XPC) 蛋白在细胞紫外线照射下以 UV-DDB 依赖性方式泛素化。细胞提取物的免疫共沉淀实验和使用纯化蛋白的体外结合实验表明，XPC 和 UV-DDB 直接发生物理相互作用。此外，通过在昆虫细胞中同时表达DDB1和DDB2，同时表达cullin 4A和Roc1，我们纯化了具有泛素连接酶活性的UV-DDB-E3复合物，并利用其消除了XPC的泛素化反应，并使用XPC成功地进行了重构。细胞系。在该反应体系中，不仅XPC，DDB2和cullin 4A都是泛素化的底物，但在紫外线照射的细胞中，XPC泛素化是可逆的，而DDB2则迅速降解。换句话说，表明虽然XPC和DDB2被共同的E3泛素化，但它们在细胞内的命运却显着不同。另一方面，为了分析与XPC形成复合物的centrin 2的功能，我们首先鉴定了XPC中的cebtrin 2结合区域。通过在该结合区域引入三个氨基酸取代，我们创建了缺乏结合中心蛋白 2 的能力的突变型 XPC。与野生型 XPC 相比，该突变型 XPC 在细胞内和无细胞系统中的核苷酸切除修复活性均显着降低。使用纯化蛋白质的生化分析表明，centrin 2 通过复合物形成增强 XPC 受损 DNA 结合活性，从而促进修复反应。