環境ストレスに対するゲノム恒常性維持機構の解明

阐明针对环境应激的基因组稳态维持机制

基本信息

批准号：
19J10397
负责人：
多田遥人
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-25 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

ヌクレオソーム・ポジショニング配列として601配列を1コピー、その両側に5S rDNA配列を5コピーずつ導入したDNA基質を元に一本鎖環状DNAを調製し、損傷を含むオリゴヌクレオチドを601配列上にアニールさせる。これをプライマーとしてDNAポリメラーゼによる伸長反応、DNAリガーゼによる鎖連結反応を行うことで二本鎖環状DNA基質を作製し、塩化セシウムとエチジウムブロマイドを用いた密度勾配遠心法により分離・精製した。このDNA基質と精製ヒストンタンパク質、ヒストンシャペロンNAP-1を用いて試験管内でアレイの再構成を行った。また、塩化マグネシウムを用いてヌクレオソームを凝縮させ、遠心により沈殿させて上清を除くことでヌクレオソームのみを精製した。一方、ヌクレオソームに負の超らせんが蓄えられていることに着目しDNAの超らせん構造がNERに与える影響について調べるため、上記の方法で調製した二本鎖環状DNAをアガロースゲル電気泳動により精製し、超らせん構造を解消する酵素のE.coli Topoisomerase I (Topo I)と逆に超らせん構造を導入する酵素のDNA gyrase (gyrase) を用いて実験を行った。上記の方法で二本鎖環状としたDNAはリラックスした状態にあるため、まずそこにgyraseを反応させて超らせん構造を導入してから無細胞NER反応を行った。その結果、リラックスしている状態と比べて損傷の切り出し効率が上昇した。また、このとき無細胞NER反応では切り出しが確認できていなかった損傷であるCPDの切り出しも確認された。さらに超らせん構造を導入したDNA基質に対してTopo Iを反応させてから無細胞NER反応を行うと損傷の切り出し効率が低下したことから、負の超らせん構造が切り出し効率を上昇させていることが示唆された。

单链圆形DNA是基于DNA底物制备的，在DNA底物中，将601序列的一个副本用作核小体定位序列，在两侧引入5S rDNA序列的五个副本，并将含有损坏的寡核苷酸置于601序列上。将其用作底漆，通过用DNA聚合酶进行延伸反应和与DNA连接酶的链链接反应制备双链圆形DNA底物，并使用氯化纤维和溴化乙二醇的密度梯度离心进行分离和纯化。使用该DNA底物，纯化的组蛋白蛋白和组蛋白伴侣NAP-1在体外重建阵列。此外，使用氯化镁凝结核小体，通过离心沉淀，然后除去上清液以仅纯化核小体。另一方面，为了研究DNA超硅结构对NER的影响，我们专注于核小体中负超丝硅结构的储存，并研究了使用上述方法通过琼脂糖凝胶型启动纯化了DNA超硅结构对NER的DNA Super-Silicon结构对NER，双链圆形DNA的影响，并表演了Ener e e. （TOPO I），它可以分辨出超硅结构，以及引入超硅结构的酶（Gyrase）（Gyrase）。使用上述方法，双链圆形DNA处于松弛状态，因此首先将回旋酶与DNA反应，以在执行无细胞的NER反应之前引入超螺旋结构。结果，与放松状态相比，切割损伤的效率提高了。此外，也证实了CPD的切除，这是一种损害，其中未在无细胞的NER反应中确认切除。此外，当Topo I与DNA底物与超螺旋结构反应时，进行了无细胞的NER反应时，削减损伤的疗效表明负超螺旋结构提高了降低效率。

项目成果

期刊论文数量（6）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

The roles for ATPase activities of transcription factor IIH in nucleotide excision repair

转录因子 IIH ATPase 活性在核苷酸切除修复中的作用

DOI：
发表时间：
2019
期刊：
影响因子：
0
作者：
Haruto Tada;Yuki Onishi;Shigenori Iwai;Kaoru Sugasawa
通讯作者：
Kaoru Sugasawa

Differential requirements for the EF-hand domains of human centrin 2 in primary ciliogenesis and nucleotide excision repair

DOI：
10.1242/jcs.228486
发表时间：
2019-10-01
期刊：
JOURNAL OF CELL SCIENCE
影响因子：
4
作者：
Khouj, Ebtissal M.;Prosser, Suzanna L.;Morrison, Ciaran G.
通讯作者：
Morrison, Ciaran G.

ヌクレオチド除去修復におけるTFIIHのATPアーゼの役割

TFIIH 的 ATP 酶在核苷酸切除修复中的作用

DOI：
发表时间：
2019
期刊：
影响因子：
0
作者：
多田遥人;大西優貴;岩井成憲;菅澤薫
通讯作者：
菅澤薫

Processing of a single ribonucleotide embedded into DNA by human nucleotide excision repair and DNA polymerase η

通过人核苷酸切除修复和 DNA 聚合酶 η 处理嵌入 DNA 的单个核糖核苷酸

DOI：
10.1038/s41598-019-50421-8
发表时间：
2019
期刊：
Scientific Reports
影响因子：
4.6
作者：
Sassa Akira;Tada Haruto;Takeishi Ayuna;Harada Kaho;Suzuki Megumi;Tsuda Masataka;Sasanuma Hiroyuki;Takeda Shunichi;Sugasawa Kaoru;Yasui Manabu;Honma Masamitsu;Ura Kiyoe
通讯作者：
Ura Kiyoe

National Institutes of Health(米国)

美国国立卫生研究院