無細胞系を用いた色素性乾皮症C群蛋白質複合体(XPC-hHR23B)の機能解析

使用无细胞系统对着色性干皮病 C 组蛋白复合物 (XPC-hHR23B) 进行功能分析

• 批准号: 10151227
• 负责人: 益谷 央豪
• 金额: $ 2.94万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10151227/
• 关键词: 色素性乾皮症(XP); ヌクレオチド除去修復; 損傷認識; XPC-hHR23B

色素性乾皮症(XP)は、ヒトの常染色体性劣性遺伝病であり、ヌクレオチド除去修復機構(NER)に欠損をもっAがらGの7つの相補性群に分類されている。NERには、少なくとも2つの機構があり、1つはTCR(transcription-coupled rcpair)、他方はGGR(g10bal genome repair)と呼ばれている。TCRは転写の鋳型鎖上における速い修復、GGRはそれ以外の領域での遅い修復機構である。MPC蛋白質は、他のXP蛋白質とは異なり、GGRにのみ特異的に要求される因子である。我々は、XPC-hHR23Bを同定して解析を行ってきた。本研究では、MPC-hHR23B蛋白質の機能を明かにすることにより、GGRの機構を明かにするとともに、TCR機構解析へ向けての足掛かりとすることを目的とした。NER反応において、MPC-hHR23B複合体および他の因子がどのような順番で損傷DNA上に導入されているのかを明らかにするために、NER反応の競合実験を行った。2つの大きさの異なるプラスミドDNAに、均等に損傷を与えたものを用意し、それぞれ異なる蛋白質と混ぜ合わせた後は、2つの反応系を混合し、どちらのプラスミドが優先的に修復されるかを調べた。MPC蛋白質を欠損しているXP-C群細胞抽出液と、XPA蛋白質を欠損しているXP-A群細胞抽出液間で競合実験を行ったところ、XPA蛋白質よりXPC蛋白質の方が速い段階でNERに関与していることが示された。さらに、精製したXPC-hHR23B複合体と、XP-C群細胞抽出液とについて同様の解析を行ったところ、XPC-hHR238複合体と反応させたプラスミド上での優先的な修復反応が見られた。上記より、XPC-hHR23B複合体は、損傷の認識に関与していると予想される。そこで、XPC-hHR23B複合体の損傷DNA結合活性について検討した。その結果、N-AAAF、紫外線照射、cisplatin処理したものについて、XPC蛋白質の優先的な結合が見られた。さらに、紫外線照射による主要なDNA損傷の一つである(6-4)光産物を一箇所にのみ導入した基質を作成し、DNaseIワットプリント法を行ったところ、XPC-hHR23B蛋白質が、損傷周辺に結合していることを明らかにした。これらの結果より、XPC-hHR23B複合体が、自身で損傷を認識し、NERの開始因子として働いていることが明らかになった。

着色性干皮病（XP）是一种人类常染色体隐性遗传病，分为A至G七个互补组，存在核苷酸切除修复机制（NER）缺陷。 NER 至少有两种机制，一种称为 TCR（转录耦合 rcpair），另一种称为 GGR（g10bal 基因组修复）。 TCR是转录模板链上的快速修复机制，GGR是其他区域的慢速修复机制。 MPC 蛋白与其他 XP 蛋白不同，是仅 GGR 专门需要的因子。我们已经鉴定并分析了 XPC-hHR23B。在本研究中，我们旨在通过阐明MPC-hHR23B蛋白的功能来阐明GGR的机制，并以此作为分析TCR机制的垫脚石。为了阐明NER反应过程中MPC-hHR23B复合物和其他因子被引入到受损DNA上的顺序，我们进行了NER反应的竞争实验。准备两个同样受损的不同大小的质粒DNA，将它们与不同的蛋白质混合，然后混合两个反应系统，以确定我研究的优先修复哪个质粒。当我们对缺乏MPC蛋白的XP-C组细胞的提取物和缺乏XPA蛋白的XP-A组细胞的提取物进行竞争实验时，我们发现XPC蛋白比XPA蛋白参与得更快。 NER。此外，当对纯化的XPC-hHR23B复合物和XP-C组细胞提取物进行类似分析时，在与XPC-hHR238复合物反应的质粒上观察到优先修复反应。综上所述，XPC-hHR23B复合物有望参与损伤识别。因此，我们研究了 XPC-hHR23B 复合物受损的 DNA 结合活性。结果，对于用 N-AAAF、UV 照射和顺铂治疗的那些，观察到 XPC 蛋白的优先结合。此外，当我们制备仅在一个位置引入光产物（紫外线照射引起的主要 DNA 损伤之一 (6-4)）的基质并进行 DNaseI Wattprint 方法时，我们发现 XPC-hHR23B蛋白质被发现与这些结果表明，XPC-hHR23B 复合物能够自行识别损伤并充当 NER 的启动因子。