無細胞系を用いた色素性乾皮症C群蛋白質複合体(XPC-hHR23B)の機能解析

使用无细胞系统对着色性干皮病 C 组蛋白复合物 (XPC-hHR23B) 进行功能分析

• 批准号: 10151227
• 负责人: 益谷 央豪
• 金额: $ 2.94万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10151227/
• 关键词: 色素性乾皮症(XP); ヌクレオチド除去修復; 損傷認識; XPC-hHR23B; 色素性乾皮症(XP); ヌクレオチド除去修復; 損傷認識; XPC-hHR23B

色素性乾皮症(XP)は、ヒトの常染色体性劣性遺伝病であり、ヌクレオチド除去修復機構(NER)に欠損をもっAがらGの7つの相補性群に分類されている。NERには、少なくとも2つの機構があり、1つはTCR(transcription-coupled rcpair)、他方はGGR(g10bal genome repair)と呼ばれている。TCRは転写の鋳型鎖上における速い修復、GGRはそれ以外の領域での遅い修復機構である。MPC蛋白質は、他のXP蛋白質とは異なり、GGRにのみ特異的に要求される因子である。我々は、XPC-hHR23Bを同定して解析を行ってきた。本研究では、MPC-hHR23B蛋白質の機能を明かにすることにより、GGRの機構を明かにするとともに、TCR機構解析へ向けての足掛かりとすることを目的とした。NER反応において、MPC-hHR23B複合体および他の因子がどのような順番で損傷DNA上に導入されているのかを明らかにするために、NER反応の競合実験を行った。2つの大きさの異なるプラスミドDNAに、均等に損傷を与えたものを用意し、それぞれ異なる蛋白質と混ぜ合わせた後は、2つの反応系を混合し、どちらのプラスミドが優先的に修復されるかを調べた。MPC蛋白質を欠損しているXP-C群細胞抽出液と、XPA蛋白質を欠損しているXP-A群細胞抽出液間で競合実験を行ったところ、XPA蛋白質よりXPC蛋白質の方が速い段階でNERに関与していることが示された。さらに、精製したXPC-hHR23B複合体と、XP-C群細胞抽出液とについて同様の解析を行ったところ、XPC-hHR238複合体と反応させたプラスミド上での優先的な修復反応が見られた。上記より、XPC-hHR23B複合体は、損傷の認識に関与していると予想される。そこで、XPC-hHR23B複合体の損傷DNA結合活性について検討した。その結果、N-AAAF、紫外線照射、cisplatin処理したものについて、XPC蛋白質の優先的な結合が見られた。さらに、紫外線照射による主要なDNA損傷の一つである(6-4)光産物を一箇所にのみ導入した基質を作成し、DNaseIワットプリント法を行ったところ、XPC-hHR23B蛋白質が、損傷周辺に結合していることを明らかにした。これらの結果より、XPC-hHR23B複合体が、自身で損傷を認識し、NERの開始因子として働いていることが明らかになった。

静脉色素沉着（XP）是人类的常染色体隐性遗传疾病，分为七组A-G组，在核苷酸切除修复机制（NER）中存在缺陷。 NER至少具有两种机制，一种称为TCR（转录耦合RCPAIR），另一种称为GGR（G10BAL基因组修复）。 TCR是转录模板的快速修复，而GGR是其他地区的缓慢修复机构。与其他XP蛋白不同，MPC蛋白仅是GGRS所需的因素。我们已经确定并分析了XPC-HHR23B。这项研究旨在揭示MPC-HHR23B蛋白的功能，并揭示GGR的机制并为TCR机理分析提供垫脚石。在NER反应中，进行了竞争性实验，以确定MPC-HHR23B复合物以及其他因素被引入受损的DNA的顺序。将两个不同尺寸的质粒DNA用相等的损伤制备，并将它们与不同的蛋白质混合后，将两个反应系统混合在一起，以确定哪种质粒优先修复。竞争实验是在缺乏MPC蛋白缺乏的XP-C组细胞提取物和缺乏XPA蛋白的XP-A组细胞提取物之间进行的，并且与XPA蛋白相比，XPC蛋白在NER中参与NER。此外，对纯化的XPC-HHR23B复合物和XP-C组细胞提取物进行了类似的分析，并在与XPC-HHR238复合物反应的质粒上观察到了优先修复反应。基于上述情况，预计XPC-HHR23B复合物参与了损害的识别。因此，研究了XPC-HHR23B复合物的DNA结合活性受损。结果，观察到XPC蛋白的优先结合，用于N-AAAF，紫外线照射和顺铂治疗。此外，仅在一个位置引入了底物（6-4），其中仅在一个位置引入了光产物（6-4），这是紫外线照射引起的主要DNA损伤之一，并执行了DNASEI WATTPRINTING方法，表明XPC-HHR23B蛋白质围绕该区域绑定到损害周围的区域。这些结果表明，XPC-HHR23B复合物识别损害，并充当NER的发起者。