ヌクレオソーム構造に特異的なヌクレオチド除去修復機構の解析

核小体结构特有的核苷酸切除修复机制分析

基本信息

批准号：
09771981
负责人：
益谷央豪
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

sV40のミニ染色体を用いた無細胞ヌクレオチド除去修復系の精製因子による再構成を目指し、昨年度中に、裸のプラスミドDNAを用いた系により明らかにされている既知のヌクレオチド除去修復因子のうち反応の初期過程、即ちDNA鎖の切断までに必要な因子である、XPA、MPC-hHR23B、XPF-ERCC1、XPG、RPA、TFIIHを精製した。本年度は、これらの因子を用いて、反応系を再構成し、その反応機構について明らかにし、さらにヌクレオソーム構造上の損傷に特異的に要求される因子の検索を目的とした。まず、精製因子による再構成を試みたところ、上記の因子により、裸のDNA上における修復反応に比べて効率は低いものの修復反応が再構成された。しかし、粗抽出液を分画して得た画分に比べ、特に、RPAについて、粗抽出液画分よりも精製酵素では、多量の蛋白質を添加する必要があった。この結果より、粗抽出液中には、RPAの活性化、もしくは、RPAと協調的に機能する未同定の因子が存在すると考えられる。現在、この因子の同定を試みている。すでに、我々は、粗抽出液系を用いて、XPC-hHR23B複合体が、ヌクレオチド除去修復反応において最初に損傷DNAを認識する因子であることを示している。そこで、精製酵素による再構成系を用いて、各因子がどのような順番で反応に関与するかを調べた。その結果、XPC-hHR23B複合体が、やはり、最初に必要なこと、続いて、TFIIH複合体が、損傷DNAとXPC-hHR23Bとの複合体上へ導入されることを明らかにした。

为了使用 sV40 微型染色体使用纯化因子重建无细胞核苷酸切除修复系统，在上一财年，我们研究了使用裸质粒 DNA 的系统揭示的已知核苷酸切除修复因子的反应，我们纯化了 XPA， MPC-hHR23B、XPF-ERCC1、XPG、RPA 和 TFIIH，它们是初始过程（即 DNA 链切割）所需的因子。今年，我们的目标是利用这些因子重建反应体系，阐明反应机制，并寻找破坏核小体结构所需的特定因子。首先，当我们尝试使用纯化因子重构时，上述因子重构了修复反应，尽管效率低于裸DNA。然而，与通过分馏粗提取物获得的级分相比，特别是对于RPA，需要向纯化酶中添加比粗提取物级分更多的蛋白质。根据该结果，认为粗提取物中存在未鉴定的激活RPA或与RPA协同发挥作用的因子。我们目前正在尝试确定这个因素。此前，我们使用粗提物系统证明，XPC-hHR23B复合物是核苷酸切除修复反应中识别受损DNA的第一个因子。因此，我们使用使用纯化酶的重构系统来研究每个因子参与反应的顺序。结果显示，仍然首先需要XPC-hHR23B复合物，然后将TFIIH复合物引入到受损DNA和XPC-hHR23B的复合物上。