HMGタンパク質のDNA結合ドメイン構造と認識機構の解析

HMG蛋白DNA结合域结构及识别机制分析

基本信息

批准号：
08260218
负责人：
吉田充輝
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Tokyo University of Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.HMG2のDNA結合領域の構造解析:HMG2のcDNAよりドメインAB(AとBがリンカーを挟んで連結した配列を大腸菌で高発現させ、均一になるまで精製する系を確立した。この系を用いて、同位体で標識した試料を調製し、現在大阪大学蛋白質研究所など3研究機関の協力のもとNMRによる高次構造解析を進行中である。また、奈良先端技術大学院大学の協力のもとにDNAとの複合体についてX線回折による解析も同時進行中である。2.部位特異的変異を導入したHMG2のDNA結合領域をもちいた結合機構の解析:立体構造保持(疎水性コアを形成する疎水性アミノ酸)やDNAとの結合(塩基性アミノ酸)、インタカレーションに関与すると期待されるアミノ酸残基を部位特異的変異法により他残基に置換したドメインBを大腸菌で高発現させ、精製した。これら変異体とDNAとの相互作用をゲルシフトアッセイ、表面プラズモン共鳴現象を測定するBIAcore装置によって解析したところ、全ての変異体で結合能の変化と立体構造の差異が観察された。以上の結果より、これらのアミノ酸の構造保持と結合における重要性を明らかにした。3.示差走査熱量計をもちいたDNA-HMG2複合体の熱安定性の解析:DNAとの複合体の安定性を測定する前段階としてペプチド単独で測定を行なった。その結果、加熱とともにペプチドが凝集し、測定が不可能となった。現在、凝集の原因と考えられるシステイン残基に変異を導入したペプチドを調製し、解析を行なっている。4.新しいDNA結合タンパク質EPF-5の構造解析:DNA結合機構の解析の一環として、花の組織の特異的発現に関与するZn-Finger型DNA結合性タンパク質EPF-2-5のNMRによる高次構造解析を進行中である。

1。对HMG2的DNA结合区域的结构分析：从HMG2的cDNA（域AB（A和B）（A和B）之间的序列高度表达序列，并在两者之间的接头上连接，并建立一个系统以将其纯化直到其变为均匀。该系统是使用同位素签署的样品建立的，我们目前正在通过包括大阪大学蛋白质研究所在内的三个研究机构的合作进行奈良高级科技大学的高级结构分析。还在对DNA的DNA结合区域进行分析，DNA的DNA结合区域是对DNA连接的分析（疏水性核心（疏水性核心（高度表达高度表达的结构域B），氨基酸残基预计将涉及在疏水性氨基酸中，DNA（碱性氨基酸）和访谈被其他残基用特异性突变方法代替。从上述结果中，这些氨基酸在结构维持和结合中的重要性3.分析DNA-HMG2（由于性别的测量）。由于加热而无法使用肽。 EPF-2-5 NMR的高阶结构分析正在进行中。