HMGタンパク質のDNA結合ドメイン構造と認識機構の解析

HMG蛋白DNA结合域结构及识别机制分析

基本信息

批准号：
08260218
负责人：
吉田充輝
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Tokyo University of Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.HMG2のDNA結合領域の構造解析:HMG2のcDNAよりドメインAB(AとBがリンカーを挟んで連結した配列を大腸菌で高発現させ、均一になるまで精製する系を確立した。この系を用いて、同位体で標識した試料を調製し、現在大阪大学蛋白質研究所など3研究機関の協力のもとNMRによる高次構造解析を進行中である。また、奈良先端技術大学院大学の協力のもとにDNAとの複合体についてX線回折による解析も同時進行中である。2.部位特異的変異を導入したHMG2のDNA結合領域をもちいた結合機構の解析:立体構造保持(疎水性コアを形成する疎水性アミノ酸)やDNAとの結合(塩基性アミノ酸)、インタカレーションに関与すると期待されるアミノ酸残基を部位特異的変異法により他残基に置換したドメインBを大腸菌で高発現させ、精製した。これら変異体とDNAとの相互作用をゲルシフトアッセイ、表面プラズモン共鳴現象を測定するBIAcore装置によって解析したところ、全ての変異体で結合能の変化と立体構造の差異が観察された。以上の結果より、これらのアミノ酸の構造保持と結合における重要性を明らかにした。3.示差走査熱量計をもちいたDNA-HMG2複合体の熱安定性の解析:DNAとの複合体の安定性を測定する前段階としてペプチド単独で測定を行なった。その結果、加熱とともにペプチドが凝集し、測定が不可能となった。現在、凝集の原因と考えられるシステイン残基に変異を導入したペプチドを調製し、解析を行なっている。4.新しいDNA結合タンパク質EPF-5の構造解析:DNA結合機構の解析の一環として、花の組織の特異的発現に関与するZn-Finger型DNA結合性タンパク質EPF-2-5のNMRによる高次構造解析を進行中である。

1。对HMG2的DNA结合区域进行的结构分析：建立了一个系统，该系统在该系统中（A和B连接在一起，由HMG2中的hmg2的连接器链接在一起，在大肠杆菌中高度表达了大肠杆菌中的高度表达，并纯化了与ISMOPES的均质分析，并在较高的情况下进行了与Ismrs的合作，并进行了较高的序列。包括大阪大学蛋白质研究所，包括NARA先进技术研究生的合作，引入了X射线衍射分析。（形成疏水核的疏水氨基酸），与DNA（碱性氨基酸）结合（碱性氨基酸）和插入率在大肠杆菌中高度表达并纯化。这些突变体与DNA之间的相互作用被采用。使用凝胶转移测定法和测量表面等离子体共振现象的Biacore仪器的分析显示，所有突变体的结合能力和结构差异的变化。以上结果揭示了这些氨基酸在结构的保留和结合中的重要性。 3。分析具有差异扫描量热仪的DNA-HMG2复合物的热稳定性：单独测量肽作为测量与DNA络合物稳定性的预阶段。结果，与加热聚集的肽，使得无法测量。当前，正在制备和分析已经引入半胱氨酸残基突变的肽，被认为是聚集的原因。 4。新的DNA结合蛋白EPF-5的结构分析：作为对DNA结合机制的分析的一部分，我们目前正在对基于NMR的结构进行基于NMR的结构分析分析Zn手指型DNA结合蛋白EPF-2-5，这参与了花组织的特定表达。