HMGboxのDNA結合機構および転写反応における役割の研究

HMGbox DNA结合机制及其在转录反应中的作用研究

基本信息

批准号：
05680534
负责人：
吉田充輝
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Tokyo University of Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

高等動植物の細胞核に存在する核タンパク質HMG1およびHMG2(以下HMG1/2と略)は、DNA結合性である。そのDNA結合モチーフ(HMG-box)は、多くの転写因子に存在し、そのDNA認識と結合の機構、転写における係わりあいが注目されつつある。本研究では、HMG-boxを高発現、精製後、高次構造を明らかにし、HMG-boxのDNAの認識と結合機構について解明することを目的とした。HMG1/2に2つずつ含まれるHMG-box(ドメインA、ドメインB)をコードするcDNAを発現プラスミドに挿入し、T7システムをもちいて大腸菌内で高発現させた。菌体より、各HMG-boxを均一になるまで精製し、現在大阪大学蛋白質研究所の協力のもと、NMRによる高次構造解析を行なっている。次に、各HMG-boxとDNAとの結合機構について、ゲルシフトアッセイをもちいて解析した。その結果、各ドメイン単独ではDNA結合性は持つものの、HMG1/2で認められるDNA高次構造に対する優先的結合、および協同的結合性は認められなかった。また、DNAの巻戻し活性を調べたところ、各HMG-boxでは、ほとんど活性が認められなかったが、両HMG-boxをもつ構成物では巻戻し活性が認められた。以上のことから、HMG1/2の2つのHMG-boxは、DNA結合性を持つが、DNA構造に対する特異性および強力な結合性を示すには、両HMG-boxがタンデムに結合していることが必要であることが示唆された。

较高植物和植物的细胞核中存在的核蛋白HMG1和HMG2（以下称为HMG1/2）是DNA结合的。这种DNA结合基序（HMG-box）存在于许多转录因子中，其DNA识别，结合机制及其参与转录的参与变得越来越吸引注意力。这项研究旨在阐明HMG-box高表达和纯化后的高阶结构，并阐明HMG-box的DNA识别和结合机理。 HMG1/2中包含的HMG-Box（域A，域B）的cDNA被插入表达质粒中，并使用T7系统在大肠杆菌中高度表达。每个HMG-box从细菌纯化直至均匀，目前正在通过大阪大学蛋白研究所的合作进行NMR分析。接下来，使用凝胶移位测定法分析了每个HMG-box和DNA之间的结合机制。结果，尽管单独的每个结构域具有DNA结合，但未观察到与HMG1/2中发现的DNA高阶结构的优先结合或合作结合。此外，当检查了DNA时，每个HMG盒的活性很小，但是在两个HMG盒的构造中都观察到了放松的活性。从以上提出，尽管HMG1/2的两个HMG盒具有DNA结合特性，但两个HMG-boxE都必须串联结合，以显示特异性和与DNA结构的强大结合。