核蛋白質による十字型DNA構造の特異的識別・結合の様式および同構造解消の機構

核蛋白对十字形DNA结构的特异性识别、结合方式及其溶解机制

基本信息

批准号：
04254215
负责人：
吉田充輝
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Tokyo University of Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1990
资助国家：
日本
起止时间：
1990 至 1992
项目状态：
已结题

项目摘要

1.HMG box、およびDNAとHMG boxとの複合体の立体構造解析:HMG2のcDNAよりDNA結合領域“HMG box"A,BおよびA+BをコードするcDNAをTクプロモーターをもつプラスミドpGEMに組み込み、大腸菌の中で単独分子として、それぞれ高発現できる系を確立した。高発現したポリペプチドをそれぞれ分離精製する方法を見いだした。現在、多量の試料を調製中であり、引きつづき大阪大学との共同研究により、結晶化とX線回折、およびNMPによる立体構造解析を行なう。2、HMG boxとDNAとの結合様式の解明:HMG boxとDNAとの結合を解析するためのゲルシフトアッセイ条件を設定した。この系でHMG2のHMG boxBとプラミドDNAとの結合と測定したところ、超らせん型、弛緩型、直鎖型のいずれのDNA型にも同程度の結合を示し、また超らせん型DNAへの結合の程度はHMG2に比較して弱かった。これらの結果から、HNG2の超らせん型DNAに対する強い、優先的結合にはHMG boxA,Bの2つが相揃い、その相互作用が必須であることが示された。3、転写反応におけるHMG boxの影響解析:動物培養細胞COS-1における外来遺伝子の発現活性によりHMG1の効果を検定したところ、HMG1の発現に伴い、外来遺伝子の発現が数倍増加した。さらに、この発現上昇は転写段階での促進によることが明らかになった。一方、HMG1の変異タンパク質を構築し、その発現に対する影響を検索した結果、HNG boxA+Bのみではレポータ遺伝子の発現が抑えられた。この結果、HMG boxはDNA結合活性を有するのみであり、HMG1分子のC末端の酸性アミノ酸領域が転写領域が転写促進の機能をドメインであることが明りかとなった。

1. HMG 盒以及 DNA 和 HMG 盒之间的复合物的三维结构分析：从 HMG2 cDNA 中，将编码 DNA 结合区“HMG 盒”A、B 和 A+B 的 cDNA 转移至质粒 pGEM，我们建立了一个系统，允许每个分子在大肠杆菌中高表达。我们找到了一种分离和纯化高表达多肽的方法。我们目前正在准备大量样品，并将继续与大阪大学合作使用NMP进行结晶、X射线衍射和三维结构分析。 2.阐明HMG盒与DNA之间的结合模式：我们设定凝胶迁移实验条件来分析HMG盒与DNA之间的结合。当我们测量该系统中HMG2的HMG boxB与质粒DNA之间的结合时，我们发现它与超螺旋、松弛和线性DNA类型的结合程度相同，并且与超螺旋DNA的结合程度也很弱。与HMG2相比。这些结果表明，HMG 盒 A 和 B 是对齐的，它们的相互作用对于 HNG2 与超螺旋 DNA 的强力和优先结合至关重要。 3、HMG盒对转录反应的影响分析：通过培养动物细胞COS-1中外源基因的表达活性来检测HMG1的影响，发现外源基因的表达量随着HMG1的表达量增加数倍。此外，还表明这种表达的增加是由于转录阶段的促进。另一方面，通过构建HMG1突变蛋白并研究其对表达的影响，我们发现HNG boxA+B单独抑制报告基因的表达。结果表明，HMG盒仅具有DNA结合活性，HMG1分子C末端的酸性氨基酸区域是作为促进转录的结构域起作用的转录区域。