核蛋白質による十字型DNA構造の特異的識別・結合の様式および同構造解消の機構

核蛋白对十字形DNA结构的特异性识别、结合方式及其溶解机制

基本信息

批准号：
04254215
负责人：
吉田充輝
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Tokyo University of Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1990
资助国家：
日本
起止时间：
1990 至 1992
项目状态：
已结题

项目摘要

1.HMG box、およびDNAとHMG boxとの複合体の立体構造解析:HMG2のcDNAよりDNA結合領域“HMG box"A,BおよびA+BをコードするcDNAをTクプロモーターをもつプラスミドpGEMに組み込み、大腸菌の中で単独分子として、それぞれ高発現できる系を確立した。高発現したポリペプチドをそれぞれ分離精製する方法を見いだした。現在、多量の試料を調製中であり、引きつづき大阪大学との共同研究により、結晶化とX線回折、およびNMPによる立体構造解析を行なう。2、HMG boxとDNAとの結合様式の解明:HMG boxとDNAとの結合を解析するためのゲルシフトアッセイ条件を設定した。この系でHMG2のHMG boxBとプラミドDNAとの結合と測定したところ、超らせん型、弛緩型、直鎖型のいずれのDNA型にも同程度の結合を示し、また超らせん型DNAへの結合の程度はHMG2に比較して弱かった。これらの結果から、HNG2の超らせん型DNAに対する強い、優先的結合にはHMG boxA,Bの2つが相揃い、その相互作用が必須であることが示された。3、転写反応におけるHMG boxの影響解析:動物培養細胞COS-1における外来遺伝子の発現活性によりHMG1の効果を検定したところ、HMG1の発現に伴い、外来遺伝子の発現が数倍増加した。さらに、この発現上昇は転写段階での促進によることが明らかになった。一方、HMG1の変異タンパク質を構築し、その発現に対する影響を検索した結果、HNG boxA+Bのみではレポータ遺伝子の発現が抑えられた。この結果、HMG boxはDNA結合活性を有するのみであり、HMG1分子のC末端の酸性アミノ酸領域が転写領域が転写促進の機能をドメインであることが明りかとなった。

1。对HMG盒的结构分析以及DNA和HMG盒的复合物：从HMG2的cDNA中，编码DNA结合区域“ HMG盒” A，B和A+B的cDNA与T-Promoter一起掺入质粒PGEM中，并可以高度表达为E. coli In Coli In Coli的系统。发现一种方法可以将每个高度表达的多肽分离并纯化。目前，正在准备大量样品，并与大阪大学合作，我们将继续使用NMP进行结晶，X射线衍射和3D结构分析。 2。设置了HMG盒和DNA之间的结合模式：凝胶移位测定条件以分析HMG盒和DNA之间的结合。当在该系统中测量HMG2的HMG盒与Pramide DNA的结合时，它与Hypersilicon，Raseled和线性DNA类型的结合都相似，并且与Hypersilicon DNA的结合程度较弱于HMG2。这些结果表明，HMG盒A和B对于与HNG2的超短螺旋DNA的强优先结合处于对齐状态，并且它们的相互作用至关重要。 3。分析HMG盒对转录反应的影响：当通过外国基因在动物培养的细胞COS-1中的表达活性测试HMG1的作用时，外源基因的表达随HMG1表达增加了几次。此外，揭示了这种增加的表达是由转录阶段促进引起的。另一方面，构建了HMG1的突变蛋白并寻找其对其表达的影响，而HNG Boxa+B仅抑制了报告基因的表达。结果，发现HMG盒仅具有DNA结合活性，并且HMG1分子C末端的酸性氨基酸区域的转录区域是促进转录的结构域。