核タンパク質による十字型DNA構造の特異的識別・結合の様式および同構造解消の機構

核蛋白对十字形DNA结构的特异性识别和结合方式及其溶解机制

基本信息

批准号：
03259214
负责人：
吉田充輝
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Tokyo University of Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1990
资助国家：
日本
起止时间：
1990 至 1991
项目状态：
已结题

项目摘要

1.HMG1,HMG2の一次構造上のDNA結合部位の同定:HMG1タンパク質を化学および酵素分解後、ペプチドを分離し、DNA結合能を測定した。この結果と一次構造、および最近見いだされたHMGタンパク質類似のDNA結合ドメインをもつタンパク質との比較により、結合に必要な2つの領域をほぼ特定できた。2.HMG1とHMG2のDNAへの親和性の差異の検索:前年度の研究によりゲルシフト・アッセイでHMG1,2の間にDNA結合能の大きな差異が認められた。この差異がリン酸化に由来するか否かを検索する為、脱リン酸化処理を行い、DNA結合能を比較したところ変化は認められなかった。他の結果と併せて考えると、DNA結合能の差異は両タンパク質の修飾によるのではなく、一次構造に起因するものと推定される。3.DNAとHMG2複合体の立体構造:HMG2タンパク質の上記2つの結合領域のうち、ドメインAをコ-ドするcDNAの塩基配列をPーガラクトシダ-ゼのcDNAの下流への連結し、P_Rプロモ-タ-をもつプラスミドへ挿入、大腸菌ヘトランスフォ-ムした。誘導によって高発現した融合タンパク質を分離精製後、ドメインAを酵素分解により切出し、分離精製する系を確立できた。今後、NMRおよびX線結晶回析を行い、DNA結合領域の立体構造解析を進める。4.HMG2遺伝子構造と発現制御領域の検索:ヒトHMG2遺伝子の単離にはじめて成功し、全塩基配列を決定した。この遺伝子の発現に必要な上流配列を特定し、その領域に結合する核内因子の存在を認め、結合配列を決定した。その発現促進の機構を検索中である。

1。鉴定HMG1和HMG2的一级结构上的DNA结合位点：在HMG1蛋白的化学和酶促降解后，分离了肽并测量了DNA结合能力。与新发现的HMG蛋白样DNA结合结构域相比，该结果与蛋白质和蛋白质相比，使我们能够大致识别结合所需的两个区域。 2。在HMG1和HMG2之间寻找DNA亲和力的差异：上一年的研究表明，HMG1和2之间的DNA结合能力在凝胶移位分析中存在显着差异。为了搜索是否从磷酸化中得出这种差异，进行了去磷酸化，并且在比较DNA结合能力时，未观察到变化。考虑到这与其他结果结合使用，据推测，DNA结合能力的差异不是由于两种蛋白质的修饰，而是由于主要结构的修饰。 3。DNA和HMG2复合物的结构：在HMG2蛋白的两个结合区域中，编码结构域A的cDNA的碱基序列被插入了pgalactosidase cDNA的下游，并插入载有P_R启动子的质粒中，并转化为E. coli。通过诱导分离和纯化高表达的融合蛋白后，通过酶促降解切除结构域A，并建立了一个系统以分离和纯化蛋白质。将来，将进行NMR和X射线晶体衍射，以进一步分析DNA结合区域的三维结构。 4。搜索HMG2基因结构和表达控制区域：人类HMG2基因首先成功，并确定了整个核苷酸序列。鉴定了表达该基因所需的上游序列，并观察到与该区域结合的核因子的存在，并确定结合序列。正在搜索促进其表达的机制。