核タンパク質による十字型DNA構造の特異的識別・結合の様式および同構造解消の機構

核蛋白对十字形DNA结构的特异性识别和结合方式及其溶解机制

基本信息

批准号：
03259214
负责人：
吉田充輝
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Tokyo University of Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1990
资助国家：
日本
起止时间：
1990 至 1991
项目状态：
已结题

项目摘要

1.HMG1,HMG2の一次構造上のDNA結合部位の同定:HMG1タンパク質を化学および酵素分解後、ペプチドを分離し、DNA結合能を測定した。この結果と一次構造、および最近見いだされたHMGタンパク質類似のDNA結合ドメインをもつタンパク質との比較により、結合に必要な2つの領域をほぼ特定できた。2.HMG1とHMG2のDNAへの親和性の差異の検索:前年度の研究によりゲルシフト・アッセイでHMG1,2の間にDNA結合能の大きな差異が認められた。この差異がリン酸化に由来するか否かを検索する為、脱リン酸化処理を行い、DNA結合能を比較したところ変化は認められなかった。他の結果と併せて考えると、DNA結合能の差異は両タンパク質の修飾によるのではなく、一次構造に起因するものと推定される。3.DNAとHMG2複合体の立体構造:HMG2タンパク質の上記2つの結合領域のうち、ドメインAをコ-ドするcDNAの塩基配列をPーガラクトシダ-ゼのcDNAの下流への連結し、P_Rプロモ-タ-をもつプラスミドへ挿入、大腸菌ヘトランスフォ-ムした。誘導によって高発現した融合タンパク質を分離精製後、ドメインAを酵素分解により切出し、分離精製する系を確立できた。今後、NMRおよびX線結晶回析を行い、DNA結合領域の立体構造解析を進める。4.HMG2遺伝子構造と発現制御領域の検索:ヒトHMG2遺伝子の単離にはじめて成功し、全塩基配列を決定した。この遺伝子の発現に必要な上流配列を特定し、その領域に結合する核内因子の存在を認め、結合配列を決定した。その発現促進の機構を検索中である。

1. HMG1和HMG2一级结构上DNA结合位点的鉴定：HMG1蛋白化学和酶降解后，分离肽并测量它们的DNA结合能力。通过将这些结果与一级结构和最近发现的具有与 HMG 蛋白相似的 DNA 结合结构域的蛋白质进行比较，我们能够粗略地识别出结合所需的两个区域。 2.寻找HMG1和HMG2之间DNA亲和力的差异：前一年进行的研究表明，凝胶迁移实验中HMG1和HMG2之间的DNA结合能力存在很大差异。为了研究这种差异是否是由于磷酸化造成的，进行了去磷酸化处理并比较了DNA结合能力，没有观察到变化。当与其他结果结合考虑时，推测 DNA 结合能力的差异是由于两种蛋白质的一级结构而不是修饰造成的。 3、DNA与HMG2复合物的三维结构：HMG2蛋白的上述两个结合区中，编码结构域A的cDNA碱基序列连接在P-半乳糖苷酶cDNA的下游，并且将P_R启动子插入到质粒中与目标并转化为大肠杆菌。在分离和纯化诱导高表达的融合蛋白后，我们能够建立一个通过酶降解切除结构域A并分离和纯化的系统。未来我们将通过NMR和X射线晶体衍射来分析DNA结合区域的三维结构。 4.寻找HMG2基因结构和表达调控区：我们首次成功分离出人类HMG2基因，并测定了其完整的核苷酸序列。我们鉴定了该基因表达所需的上游序列，确认了与该区域结合的核因子的存在，并确定了结合序列。我们目前正在寻找促进其表达的机制。