HMGタンパク質のDNA結合ドメイン構造と認識機構の解析

HMG蛋白DNA结合域结构及识别机制分析

基本信息

批准号：
07268219
负责人：
吉田充輝
金额：
$ 1.66万
依托单位：
Tokyo University of Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1、HMG2のDNA結合領域の構造解析:HMG2のcDNAより、DNA結合ドメインAおよびB、さらにAB(AとBがリンカーを挟んで連結した配列)をコードする配列を発現ベクターに挿入し、大腸菌内で高発現させ、均一になるまで精製する系を確立した。現在、この系を用いて標識した試料につき、大阪大学蛋白質研究所など3研究機関の協力のもと、NMRにより高次構造解析を進行中であり、基礎データを順調に蓄積しつつある。引き続き解析を継続する。また、奈良先端技術大学院大学の協力のもとにX線回折による解析も同時に進行中である。2、表面プラズモン共鳴(SPR)センサ、蛍光測定を用いたHMGタンパク質とDNAとの相互作用の解析:上記の方法でDNA結合ドメインを含む各種配列を高発現、精製した。それらとDNAとの相互作用を、表面プラズモン共鳴現象を測定するBIAcore(Pharmacia)装置を用いて解析をおこない、各DNA結合ドメインに連なる塩基性配列が強い結合と安定性に重要であることを定量的に明かにした。さらに蛍光測定法をもちいた解析より、各芳香族アミノ酸の存在状態を明らかにできた。3、HMGタンパク質によるDNA bending機構の解析:種々の長さをもつBending,Non-bending型のDNAを作成、これらを用いてHMG中のDNAの折れ曲がり反応の機能ドメインを解析、DNA結合ドメインBとそれに連なる配列が機能領域であることを明らかにした。

1。对HMG2的DNA结合区域的结构分析：从HMG2的cDNA（编码DNA结合域A和B的序列）以及AB（A和B一起链接的序列与接头链接在一起）被插入表达载体，并在E. coli中高表达以纯化为止，直到纯化为纯种。当前，NMR通过三家研究机构（包括大阪大学蛋白质研究所）的合作进行了使用该系统标记的样品的高阶结构分析，并且基本数据正在稳步积累。继续分析。此外，还与NARA高级技术研究生大学合作进行了X射线衍射分析。 2。使用表面等离子体共振（SPR）传感器和荧光测量的HMG蛋白与DNA之间的相互作用分析：使用上述方法高表达包含DNA结合结构域的各种序列。使用Biacore（Pharmacia）仪器分析这些与DNA之间的相互作用，该仪器（Pharmacia）仪器测量了表面等离子体共振现象，并定量地揭示了与每个DNA结合域相关的基本序列对于强结合和稳定性很重要。此外，使用荧光测量结果进行分析表明，每种芳族氨基酸的存在状态。 3。通过HMG蛋白来分析DNA弯曲机制：分析了HMG中DNA弯曲反应的功能结构域，分析了DNA在HMG中的弯曲功能结构域，揭示了DNA结合结构域B及其相关序列是功能区域。