HMGタンパク質のDNA結合ドメイン構造と認識機構の解析

HMG蛋白DNA结合域结构及识别机制分析

基本信息

批准号：
07268219
负责人：
吉田充輝
金额：
$ 1.66万
依托单位：
Tokyo University of Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1、HMG2のDNA結合領域の構造解析:HMG2のcDNAより、DNA結合ドメインAおよびB、さらにAB(AとBがリンカーを挟んで連結した配列)をコードする配列を発現ベクターに挿入し、大腸菌内で高発現させ、均一になるまで精製する系を確立した。現在、この系を用いて標識した試料につき、大阪大学蛋白質研究所など3研究機関の協力のもと、NMRにより高次構造解析を進行中であり、基礎データを順調に蓄積しつつある。引き続き解析を継続する。また、奈良先端技術大学院大学の協力のもとにX線回折による解析も同時に進行中である。2、表面プラズモン共鳴(SPR)センサ、蛍光測定を用いたHMGタンパク質とDNAとの相互作用の解析:上記の方法でDNA結合ドメインを含む各種配列を高発現、精製した。それらとDNAとの相互作用を、表面プラズモン共鳴現象を測定するBIAcore(Pharmacia)装置を用いて解析をおこない、各DNA結合ドメインに連なる塩基性配列が強い結合と安定性に重要であることを定量的に明かにした。さらに蛍光測定法をもちいた解析より、各芳香族アミノ酸の存在状態を明らかにできた。3、HMGタンパク質によるDNA bending機構の解析:種々の長さをもつBending,Non-bending型のDNAを作成、これらを用いてHMG中のDNAの折れ曲がり反応の機能ドメインを解析、DNA結合ドメインBとそれに連なる配列が機能領域であることを明らかにした。

1. HMG2 DNA结合区的结构分析：从HMG2 cDNA中插入编码DNA结合结构域A和B以及AB的序列（其中A和B通过其间的接头连接的序列）转化为表达载体，我们建立了一个系统，可以在细胞中高表达并纯化至同质。目前，我们正在与大阪大学蛋白质研究所等三个研究机构合作，对使用该系统标记的样品进行NMR高阶结构分析，并正在稳步积累基础数据。继续分析。同时，与奈良工业大学的合作也正在进行使用X射线衍射的分析。 2.使用表面等离子共振(SPR)传感器和荧光测量分析HMG蛋白和DNA之间的相互作用：使用上述方法高度表达和纯化含有DNA结合结构域的各种序列。我们使用测量表面等离子共振现象的 BIAcore (Pharmacia) 装置分析了它们与 DNA 的相互作用，并量化了连接到每个 DNA 结合结构域的基本序列对于强结合和稳定性的重要性。另外，通过荧光测定法的分析，揭示了各芳香族氨基酸的存在状态。 3. HMG蛋白分析DNA弯曲机制：创建不同长度的弯曲和非弯曲类型的DNA，利用它们分析HMG中DNA弯曲反应的功能域，并鉴定DNA结合域B并揭示与之相连的序列是一个功能区。