酵母CDC28キナーゼファミリーのPHO85キナーゼによる転写と細胞周期の制御

酵母 CDC28 激酶家族 PHO85 激酶对转录和细胞周期的调节

基本信息

批准号：
07254210
负责人：
西沢正文
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07254210/
关键词：
細胞周期酵母プロテインキナーゼ Cdkインヒビター

项目摘要

1. Pho85キナーゼと相互作用する因子の遺伝学的探索。pho85変異株中でG2サイクリンを過剰発現すると生育停止が起こること、pho4欠失では生育停止は抑圧されないことを見いだした。CLB2過剰発現株では大きい芽を持ち核が境界面に位置した状態で生育停止した細胞が多く観察された。pho80変異株中でCLB3を過剰発現すると芽が異常に伸長した細胞が多く観察された。これらの結果はPho85キナーゼがG2/Mの移行やM期の終了に関与している可能性を示している。細胞周期進行を阻害する薬剤のpho85変異株に対する効果を調べたところ、benomyl, MMSや紫外線照射に対しては野生株と差がなかったが、ヒドロキシ尿素に対しては感受性を示した。これはヒドロキシ尿素処理による生育停止からの回復の欠損によることがわかった。またCLB5を過剰発現するとヒドロキシ尿素に対し超感受性となった。これらの結果から、Cdc28/CIb5の阻害因子であるp40Sic1に対するPho85キナーゼの作用を調べたところ、p40Sic1がPho85キナーゼによって試験管内でリン酸化されること、pho85変異株中ではp40Sic1の分解が遅くなることを見いだした。これによりPho85キナーゼの標的の一つがCdkインヒビター(CKI)であるp40Sic1であり、Pho85キナーゼがCKIの分解を促進することにより、細胞周期進行に関与する可能性が示された。2. Pho85キナーゼと相互作用する因子の生化学的探索。酵母抽出液のゲル濾過、抗体アフィニティーカラム、およびGST-Pho85をリガンドとするアフィニティーカラムによる分析により、Pho85が他の数種の蛋白質と複合体を形成していること、複合体の形成にはPho80が重要な役割を果していることがわかった。3. Pho85キナーゼの機能ドメインの解析。種々のPho85キナーゼの変異体とPho80との結合親和性を調べたところ、E53A変異体はPho80に結合せず、K58A変異体は結合力が弱くなっていることがわかった。またPHO80を過剰発現するとE53A変異は抑圧されなかったが、K58A変異は抑圧された。これらのことから、E53残基はPho80との結合に重要であることがわかった。4. SKO1/ACR1とPHO85との遺伝的相互作用の解析。RAS-cAMP経路の下流に位置すると考えられるSKO1とPHO85との遺伝的相互作用をsko1欠失変異の導入あるいはSKO1過剰発現により調べたが、pho85変異形質の抑圧は見られなかった。

1. 基因搜索与 Pho85 激酶相互作用的因子。我们发现 pho85 突变株中 G2 细胞周期蛋白的过度表达导致生长停滞，而 pho4 缺失并不能抑制生长停滞。在CLB2过表达菌株中，观察到许多位于界面处具有大芽和细胞核的细胞已停止生长。当 CLB3 在 pho80 突变体中过表达时，观察到许多细胞具有异常伸长的芽。这些结果表明Pho85激酶可能参与G2/M转变和M期的退出。当我们研究抑制细胞周期进程的药物对pho85突变株的影响时，突变株与野生株对苯菌灵、MMS和紫外线照射没有差异，但对羟基脲表现出敏感性。发现这是由于羟基脲治疗引起的生长停滞恢复过程中存在缺陷。此外，CLB5的过度表达导致对羟基脲的过敏。基于这些结果，我们研究了Pho85激酶对Cdc28/CIb5抑制剂p40Sic1的影响，发现p40Sic1在体外被Pho85激酶磷酸化，并且在我发现的pho85突变株中p40Sic1的降解被延迟。它。这表明Pho85激酶的靶标之一是Cdk抑制剂（CKI）p40Sic1，Pho85激酶可能通过促进CKI的降解参与细胞周期进程。 2.生化寻找与Pho85激酶相互作用的因子。使用酵母提取物凝胶过滤、抗体亲和柱和以 GST-Pho85 作为配体的亲和柱进行分析表明，Pho85 与其他几种蛋白质形成复合物发挥着重要作用。 3.Pho85激酶功能域分析。当我们研究各种Pho85激酶突变体与Pho80的结合亲和力时，我们发现E53A突变体不与Pho80结合，而K58A突变体的结合强度较弱。此外，当PHO80过表达时，E53A突变没有被抑制，但K58A突变被抑制。这些结果表明 E53 残基对于与 Pho80 的结合很重要。 4. SKO1/ACR1与PHO85之间的遗传相互作用分析。我们通过引入 sko1 缺失突变或过表达 SKO1，研究了 SKO1 和 PHO85 之间的遗传相互作用，PHO85 被认为位于 RAS-cAMP 通路下游，但没有观察到对 pho85 突变性状的抑制。