酵母細胞周期進行の補機エンジンとブレーキによる制御機構と創薬への応用

辅助引擎和制动器控制酵母细胞周期进程的机制及其在药物发现中的应用

基本信息

批准号：
08660118
负责人：
西沢正文
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08660118/
关键词：
細胞周期サイクリン依存性キナーゼ Cdkインヒビター酵母

项目摘要

酵母Cdkファミリーに属するCdc28キナーゼとPho85キナーゼによる細胞周期制御の役割分担を調べるために、Pho85キナーゼによるS期のCdk阻害因子Sic1のリン酸化機構と、Pho85キナーゼのチェックポイントへの関与について実験を行った。1.Pho85キナーゼによるSic1のリン酸化。Pho85キナーゼがSic1をリン酸化するときのサイクリンパートナーを同定するために、Clb2,Clb5,Pcl1,Pcl2,Pho80をそれぞれ大腸菌細胞中で発現させ、それぞれのサイクリンを含む細胞抽出液を調製した。これと大腸菌から精製したPho85キナーゼを組み合わせ、Sic1のリン酸化能を調べたところ、Pho85-Pcl1複合体のみがSic1をリン酸化できることを見いだした。Cdc28-Cln2複合体も試験管内でSic1をリン酸化できることが知られているので、Cdc28とPho85によるSic1リン酸化の役割分担を調べた。Sic1分子中の3カ所のCdkによるリン酸化可能部位の変異体を作成し、野生株及びpho85欠失株中で過剰発現させたところどちらの株もG2期で生育が停止した。そこでリン酸化可能部位を一カ所ずつ残した変異体を過剰発現させたところ、pho85欠失株の生育は阻害するが野生株のそれは阻害しないものがあった。このことはCdc28とPho85がSic1の異なる部位をリン酸化している可能性を示している。2.ヒドロキシウレア、ベノミル、紫外線照射などのpho85欠失株に対する影響を調べたところ、pho85欠失株はヒドロキシウレアのみに超感受性であることがわかった。しかしヒドロキシウレア処理後の生存率は64%であり、pho85変異はチェックポイントには影響しないことがわかった。

为了探讨属于酵母Cdk家族的Cdc28激酶和Pho85激酶在细胞周期控制中的角色共享，我们对Pho85激酶对Cdk抑制剂Sic1在S期的磷酸化机制以及Pho85激酶的参与进行了实验。在检查站。 1. Pho85 激酶对 Sic1 的磷酸化。为了鉴定当 Pho85 激酶磷酸化时的细胞周期蛋白伙伴，Sic1、Clb2、Clb5、Pcl1、Pcl2 和 Pho80 分别在大肠杆菌细胞中表达，并制备了含有每种细胞周期蛋白的细胞提取物。当他们将其与从大肠杆菌中纯化的 Pho85 激酶结合并检查磷酸化 Sic1 的能力时，他们发现只有 Pho85-Pcl1 复合物可以磷酸化 Sic1。由于已知 Cdc28-Cln2 复合物也能够在体外磷酸化 Sic1，因此我们研究了 Cdc28 和 Pho85 共享 Sic1 磷酸化的作用。当我们在 Sic1 分子中创建可被 Cdks 磷酸化的三个位点的突变体并在野生型菌株和 pho85 缺失菌株中过表达它们时，两种菌株的生长都停止在 G2 期。当我们过度表达使每个磷酸化位点保持完整的突变体时，我们发现它们抑制了 pho85 缺失菌株的生长，但不抑制野生型。这表明 Cdc28 和 Pho85 可能磷酸化 Sic1 上的不同位点。 2.当我们研究羟基脲、苯菌灵和紫外线照射对pho85缺失菌株的影响时，我们发现pho85缺失菌株仅对羟基脲超敏感。然而，羟基脲治疗后的存活率为64%，表明pho85突变并不影响检查点。