栄養源からのシグナルによる酵母細胞周期の制御機構

营养源信号控制酵母细胞周期的机制

基本信息

批准号：
16026241
负责人：
西沢正文
金额：
$ 2.37万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

Rim101によるCLN2の発現抑制をPho85が解除する機構を解析するために、Pho85とRim101の生化学的相互作用を調べた結果、、Rim101のプロセシングは野生型株とpho85欠失株で差が見られず、さらにRim101のバンドシフトパターンにも大きな違いは見られなかった。これらのことから、Pho85が直接Rim101をリン酸化しているとは考えにくい。RIM101はアルカリ条件下で誘導されることから、pho85欠失株の細胞内pHを測定したところ、野生型株よりもアルカリ側になっていることを見いだした。これより、pho85欠失により細胞内がアルカリ条件となった結果、RIM101発現が誘導され、CLN2抑制が起きると考えるのが妥当と結論した。pho85欠失株中でPho4を過剰発現させると生育停止を引きおこす。Pho4が結合する部位を酵母ゲノム全領域について、クロマチン免疫沈降とゲノム全領域をカバーするtiling arrayへのハイブリダイゼーションを組み合わせたChIP on Chip法によって解析したところ、Pho4がCLN3,WHI5,FKH2など細胞周期を制御する遺伝子の上流域に結合することを見いだした。Pho4が実際にこれら遺伝子のプロモーター領域に結合することを、遺伝子特異的なプライマーを用いて免疫沈降クロマチン画分をPCRで増幅できることで確認した。特にFKH2発現はリン酸濃度とPho4に依存することがわかり、G2/M期の制御にPho85-Pho4が関与する可能性が示された。

为了分析Pho85解除Rim101对CLN2表达抑制的机制，我们研究了Pho85和Rim101之间的生化相互作用，发现野生型菌株和pho85缺失菌株之间对Rim101的加工存在差异此外，Rim101 的带移动模式没有观察到显着差异。基于这些发现，Pho85 不太可能直接磷酸化 Rim101。由于RIM101是在碱性条件下诱导的，我们测量了pho85缺失菌株的细胞内pH值，发现它比野生型菌株更碱性。由此，我们得出结论，可以合理地假设 RIM101 表达是由于 pho85 缺失在细胞内创造碱性条件而诱导的，从而导致 CLN2 抑制。 Pho85 缺失菌株中 Pho4 的过度表达会导致生长停滞。我们使用 ChIP on Chip 方法分析了酵母基因组所有区域中的 Pho4 结合位点，该方法将染色质免疫沉淀和杂交与覆盖整个基因组区域的平铺阵列相结合，我们发现这种蛋白质与基因的上游区域结合。控制我们通过使用基因特异性引物对免疫沉淀染色质片段进行 PCR 扩增，证实 Pho4 实际上与这些基因的启动子区域结合。特别是，发现 FKH2 表达依赖于磷酸盐浓度和 Pho4，表明 Pho85-Pho4 可能参与 G2/M 期的控制。