大脳皮質の性分化に対する性ステロイドホルモンと受容体の役割

性类固醇激素和受体对大脑皮层性别分化的作用

基本信息

批准号：
07252224
负责人：
河田光博
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Kyoto Prefectural University of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究課題では、視覚領をはじめとする大脳皮質において性ホルモンとレセプターの細胞死・生存による脳組織構築への役割を明らかにするため、レセプター蛋白の各ドメイン別のプローブと抗体を作成し、脳の発達過程において、さまざまなレセプター蛋白のアイソフォームの発現を追求した。また脳組織を培養し、培養環境を変化させてレセプター蛋白の発現や細胞死などの様相を検索することにより、生物個体が持つ内因性プログラムに対する外因子の影響の検討を行った。エストロゲン、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイドレセプターのcDNAを制限酵素によってホルモン結合ドメイン、DNA結合ドメイン、全長の異なる組み合わせのDNAフラグメントに分け、グルタチオンSトランスフェラーゼとの融合蛋白を発現するpGEX-3Xプラスミッド内に、平滑末端結合により挿入した組換えベクターを用意した。できたプラスミッドを大腸菌にトランスフォームさせ、増殖させたのち融合蛋白を可溶化し、精製した。ファクターXによって目的とする蛋白を単離、精製ののちアジュバントを作り、ウサギを免疫した。抗体の力価検定にはウエスターンブロットやELISAで行い、アフィニティカラムで抗体の精製を行った。その結果、特異性と感受性のきわめて高い抗体が得られた。脳組織をこれらの抗体を用いる免疫組織化学法により染色すると、脳のさまざまな領域に陽性細胞が分布していた。免疫電子顕微鏡を用いると免疫陽性反応は核に限局していた。エストロゲンの突起伸長作用を直接確かめるために、視束前野神経細胞を分散培養し、培養液中にエストロゲンを投与する実験を行った。エストロゲンを投与された培養神経細胞は細胞骨格蛋白の免疫陽性の突起を顕著に伸ばし、エストロゲン受容体を有していることが明らかとなった。同時にバリコシティーの数も増加していた。突起の性状については、軸索、樹状突起の明確な区別は困難であった。このことは、はっきりした細胞突起極性を有する皮質ニューロンと大きく異なる点であった。

在这个研究项目中，为了阐明性激素和受体通过大脑皮层（包括视觉区域）的细胞死亡和存活在脑组织构建中的作用，我们将为受体蛋白的每个结构域创建探针和抗体。研究了大脑发育过程中各种受体蛋白亚型的表达。我们还通过培养脑组织并改变培养环境来检查受体蛋白表达和细胞死亡等方面，研究了外部因素对个体生物体内源程序的影响。使用限制酶将雌激素、糖皮质激素和盐皮质激素受体 cDNA 分为激素结合域、DNA 结合域和不同组合的全长 DNA 片段，并置于表达与谷胱甘肽融合蛋白的 pGEX-3X 质粒中制备通过平端连接插入的重组载体。将所得质粒转化至大肠杆菌中并生长，并且溶解并纯化融合蛋白。使用X因子分离纯化目的蛋白后，制备佐剂并免疫家兔。使用蛋白质印迹或ELISA进行抗体滴度测定，并使用亲和柱进行抗体纯化。结果，获得了具有极高特异性和敏感性的抗体。当使用这些抗体对脑组织进行免疫组织化学染色时，阳性细胞分布在大脑的各个区域。使用免疫电子显微镜，免疫阳性反应定位于细胞核。为了直接证实雌激素对投射延伸的影响，我们进行了一项实验，其中视前皮层神经元被分散并培养，并且将雌激素施用到培养基中。用雌激素处理的培养神经元显着延长了细胞骨架蛋白的免疫阳性突起，表明它们具有雌激素受体。与此同时，静脉曲张的数量也在增加。关于过程的性质，很难清楚地区分轴突和树突。这是与皮质神经元的主要区别，皮质神经元具有不同的细胞过程极性。