FRETとFRAPによる脂溶性リガンド分子と受容体結合の可視化と分子相関解析

通过 FRET 和 FRAP 进行脂溶性配体分子与受体结合的可视化和分子相关分析

基本信息

批准号：
17659057
负责人：
河田光博
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Kyoto Prefectural University of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究課題では、ステロイドホルモンをはじめとする脂溶性リガンド分子の化学的蛍光標識を行い、受容体との分子相関をリアルタイムで可視化した。エストラジオールとアンドロゲンの誘導体であるジヒドロテストステロンを、リンカーを介してOH基に低分子蛍光物質BODYPY-TMあるいはAlexa 546を化学的に標識させた。蛍光標識されたこれらの脂溶性シグナル分子を、エストロゲンレセプター(ERα/b)、アンドロゲンレセプター(AR)、のプラスミドをトランスフェクションさせた培養細胞にマイクロインジェクション法で注入、あるいはジギトニン処理したセミインタクト細胞の培養液に添加した。各種培養細胞(内因性受容体を有しない細胞や内因性受容体を有する細胞)にこれらの受容体融合遺伝子を導入してタンパクの発現を行わせ、リガンド添加による蛍光像の変化を共焦点レーザー顕微鏡(Zeiss LSM-510META)、CCDカメラ設置蛍光顕微鏡を用いて観察した。受容体を強制発現させた細胞において、培養液中に標識エストロゲンを添加すると、標識リガンドは核に集積することが判明した。次に、非標識Alexa標識のエストロゲンと非標識エストロゲンをセミインタクト細胞に作用させたが、標識エストロゲンの核内での存在を認めなかった。一方、膜受容体であるとされるGPR30の細胞内分布を検索したところ、ゴルジ装置や疎面小胞体に一致してその分布が見られ、海馬神経細胞や視床下部オキシトシンニューロンに特異的な局在を認めた。これらから、膜結合型受容体の脳内での働きの解明に示唆を与える結果が得られ、in vitro, in vivoでの膜受容体と核受容体のコンバージェンスが示唆された。

在这个研究项目中，我们对脂溶性配体分子（包括类固醇激素）进行了化学荧光标记，并实时可视化它们与受体的分子关系。雌二醇和二氢睾酮（雄激素的衍生物）通过连接子在 OH 基团上用低分子荧光物质 BODYPY-TM 或 Alexa 546 进行化学标记。这些荧光标记的脂溶性信号分子可以通过显微注射注射到用雌激素受体（ERα/b）或雄激素受体（AR）质粒转染的培养细胞中，或者可以在用洋地黄皂苷处理的半完整细胞中培养。。将这些受体融合基因引入各种培养细胞（不具有内源性受体的细胞或具有内源性受体的细胞）中以表达蛋白质，并使用共聚焦激光观察由于添加配体而引起的荧光图像的变化。使用显微镜（Zeiss LSM-510META）和配备 CCD 相机的荧光显微镜进行制作。当将标记的雌激素添加到强制表达受体的细胞的培养基中时，发现标记的配体在细胞核中积聚。接下来，将未标记的Alexa标记的雌激素和未标记的雌激素应用于半完整细胞，但没有观察到细胞核中存在标记的雌激素。另一方面，当我们寻找被称为膜受体的GPR30的细胞内分布时，我们发现它的分布与高尔基体和粗面内质网一致，并且发现它具有特定的定位海马神经元和下丘脑催产素神经元的存在。这些结果为阐明大脑中膜结合受体的功能提供了建议，并表明膜受体和核受体在体外和体内的趋同。

项目成果

期刊论文数量（12）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Brain Corticosteroid Receptor Dynamics and Trafficking : Implications from Live Cell Imaging

脑皮质类固醇受体动力学和贩运：活细胞成像的影响

DOI：
发表时间：
2006
期刊：
Neuroscientist 12(2)
影响因子：
0
作者：
Motohashi;J. et al.;Nishi M.
通讯作者：
Nishi M.

Subcellular localization and dynamics of MysPDZ (Myo18A) in live mammalian cells.

DOI：
10.1016/j.bbrc.2004.11.058
发表时间：
2005-01
期刊：
Biochemical and biophysical research communications
影响因子：
3.1
作者：
Kentaro Mori;K. Matsuda;T. Furusawa;M. Kawata;Toshiaki Inoue;M. Obinata
通讯作者：
Kentaro Mori;K. Matsuda;T. Furusawa;M. Kawata;Toshiaki Inoue;M. Obinata

lntrauterine proximity to male fetuses affects the morphology of the sexually dimorphic nucleus of the preoptic area in the adult rat brain

子宫内接近雄性胎儿会影响成年大鼠大脑视前区性二形核的形态

DOI：
发表时间：
2006
期刊：
Eur J Neurosci. 23
影响因子：
0
作者：
Yoshinaga T et al.;Takahashi Y et al.;Takahashi Y et al.;Fukuhara Y et al.;Geerling J. C.;Geerling J. C.;Pei M.
通讯作者：
Pei M.

Aldosterone target neurons in the nucleus tractus solitarius drive sodium appetite