FRETを用いる低分子脂溶性活性物質レセプターの動態イメージング

利用 FRET 对小分子脂溶性活性物质受体进行动态成像

基本信息

批准号：
12877005
负责人：
河田光博
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Kyoto Prefectural University of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12877005/
关键词：
グルココルチコイドレセプターミネラルコルチコイドレセプターエストロゲンレセプター FRET 熱ショックタンパク Brg RNA pol II ヘテロダイメライゼーション CFP YFP 培養細胞リアルタイムイメージング共役因子核内動態 FRET値

项目摘要

グルココルチコイドレセプター(GR)はデキサメサゾン、コルチコステロン、アルドステロンに対しては細胞質・核移行を生じたが、エストロゲンには反応しなかった。ミネラルコルチコイドレセプター(MR)はデキサメサゾン、コルチコステロン、アルドステロンの他に、プロゲステロンに対しても細胞質・核移行を行った。これはプロゲステロンが化学構造的にアルドステロンと近似しているからと考えられた。細胞質・核移行にどのような分子シャペロンが関るのか検索した。geldanamycinは熱ショックタンパクHSP90と結合することによって、シャペロン機能を阻害する薬物である。Cos細胞において、GRとMRはいずれもgeldanamycin投与によってリガンド投与による細胞質・核移行が阻止されたことから、HSP90がその輸送に強く関っていることが明かとなった。共焦点レーザー顕微鏡によってGRとMRは核内での分布がほぼ同じ領域に認められたため、FRET解析を行った。リガンド添加による時間経過とともにFRETの頻度が増したことから、核内でのリガンド添加によるヘテロダイメライゼーションの形成が強く示唆された。性ホルモン受容体であるエストロゲンレセプターERも同様の方法で細胞内動態を解析した。また、ER(α、β)やPRなどはリガンドがない状態でもすでに核に分布しており、リガンドが作用すると核内のリセプター分布様相が変化し、ほぼ均一に分布していたレセプターが細かい粒状の斑点状になった。ER(α、β)の斑点はRNApolymeraseIIの部位とは一致せず、クロマチンのリモデリングに関る分子であるBrgと一致していた。また、ERαとβはリガンド添加(エストラジオール)によって核内でほぼ同じ部位に存在し、両者によるFRET形成が観察されたことから、これらもヘテロダイメライゼーション化していることが示唆された。

糖皮质激素受体（GR）响应地塞米松、皮质酮和醛固酮而易位至细胞质和细胞核，但对雌激素没有反应。除了地塞米松、皮质酮和醛固酮外，盐皮质激素受体 (MR) 还将孕酮转运至细胞质和细胞核。这被认为是因为黄体酮的化学性质与醛固酮相似。我们寻找什么样的分子伴侣参与细胞质/核运输。格尔德霉素是一种通过与热休克蛋白 HSP90 结合来抑制伴侣功能的药物。在Cos细胞中，配体的施用抑制GR和MR向细胞质和细胞核的施用，表明HSP90强烈参与它们的转运。由于通过共聚焦激光显微镜发现GR和MR分布在细胞核内几乎相同的区域，因此进行了FRET分析。由于配体的添加，FRET 频率随着时间的推移而增加，强烈表明由于核内配体的添加而形成了异二聚化。使用类似的方法分析了雌激素受体 ER（一种性激素受体）的细胞内动态。另外，即使在没有配体存在的情况下，ER（α，β）和PR也已经分布在细胞核中，当配体作用时，细胞核中受体的分布发生变化，原本分布几乎均匀的受体变成变成了细小的颗粒。 ER(α,β) 点与 RNA 聚合酶 II 位点不匹配，但与 Brg（一种参与染色质重塑的分子）匹配。此外，添加配体（雌二醇）后，ERα和β存在于细胞核中几乎相同的位点，并且观察到两者形成FRET，这表明它们也是异二聚化的。