FRETを用いる低分子脂溶性活性物質レセプターの動態イメージング

利用 FRET 对小分子脂溶性活性物质受体进行动态成像

基本信息

批准号：
12877005
负责人：
河田光博
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Kyoto Prefectural University of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12877005/
关键词：
グルココルチコイドレセプターミネラルコルチコイドレセプターエストロゲンレセプター FRET 熱ショックタンパク Brg RNA pol II ヘテロダイメライゼーション CFP YFP 培養細胞リアルタイムイメージング共役因子核内動態 FRET値

项目摘要

グルココルチコイドレセプター(GR)はデキサメサゾン、コルチコステロン、アルドステロンに対しては細胞質・核移行を生じたが、エストロゲンには反応しなかった。ミネラルコルチコイドレセプター(MR)はデキサメサゾン、コルチコステロン、アルドステロンの他に、プロゲステロンに対しても細胞質・核移行を行った。これはプロゲステロンが化学構造的にアルドステロンと近似しているからと考えられた。細胞質・核移行にどのような分子シャペロンが関るのか検索した。geldanamycinは熱ショックタンパクHSP90と結合することによって、シャペロン機能を阻害する薬物である。Cos細胞において、GRとMRはいずれもgeldanamycin投与によってリガンド投与による細胞質・核移行が阻止されたことから、HSP90がその輸送に強く関っていることが明かとなった。共焦点レーザー顕微鏡によってGRとMRは核内での分布がほぼ同じ領域に認められたため、FRET解析を行った。リガンド添加による時間経過とともにFRETの頻度が増したことから、核内でのリガンド添加によるヘテロダイメライゼーションの形成が強く示唆された。性ホルモン受容体であるエストロゲンレセプターERも同様の方法で細胞内動態を解析した。また、ER(α、β)やPRなどはリガンドがない状態でもすでに核に分布しており、リガンドが作用すると核内のリセプター分布様相が変化し、ほぼ均一に分布していたレセプターが細かい粒状の斑点状になった。ER(α、β)の斑点はRNApolymeraseIIの部位とは一致せず、クロマチンのリモデリングに関る分子であるBrgと一致していた。また、ERαとβはリガンド添加(エストラジオール)によって核内でほぼ同じ部位に存在し、両者によるFRET形成が観察されたことから、これらもヘテロダイメライゼーション化していることが示唆された。

糖皮质激素受体（GR）导致胞质和核易位对地塞米松，可皮质酮和醛固酮，但对雌激素没有反应。除了地塞米松，可皮质酮和醛固酮外，矿物皮质激素受体（MRS）还针对孕酮还经历了细胞质和核易位。这被认为是因为孕酮在化学上近似于醛固酮。我们搜索了哪些分子伴侣参与细胞质和核易位。 Geldanamycin是一种通过与热休克蛋白HSP90结合来抑制伴侣功能的药物。在COS细胞中，GR和MR抑制了Geldanamycin通过配体给药的细胞质和核易位，表明HSP90强烈参与其运输。由于发现GR和MR通过共聚焦激光显微镜分布在细胞核内几乎相同的区域中，因此进行了FRET分析。随着时间的流逝，FRET的频率随着配体的添加而增加，这强烈建议通过在细胞核中添加配体来形成异质化。使用相同的性激素受体ER分析细胞内动力学。此外，即使没有配体，ER（α，β）和PR也已经分布在核中，当配体起作用时，核中受体的分布变化，导致几乎均匀分布的受体形式的细粒斑点。 ER（α，β）斑点与rnapolyparase II的位点不匹配，并且与BRG一致，BRG是参与染色质重塑的分子。此外，通过添加配体（雌二醇），在核中几乎同一个位点存在ERα和β，并且观察到了两者的FRET形成，这表明这些也是异性得出的。