培養心筋におけるギャップ結合の形成および調節機構の研究

培养心肌间隙连接形成及调控机制的研究

基本信息

批准号：
02257206
负责人：
柴田洋三郎
金额：
$ 0.7万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1990
资助国家：
日本
起止时间：
1990 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-02257206/
关键词：
心筋細胞ギャップ結合細胞間連絡コネキシン色素拡散法

项目摘要

(1)エ-テル麻酔下に成獣ラットから心臓を摘出し、心房を細切コラゲナ-ゼ処理により細胞を単離し,シトシンアラビノシド存在下に10%ウシ胎仔血清加M199培地中でラミニンをコ-トしたガラス器内で培養すると、3日目に単一心筋細胞の拍動が始まり,7〜8日目にはほぼすべての細胞が周囲と同調した拍動伝達を示すようになった。この状態の培養細胞層を蛍光色素ルシファ-黄の存在下に尖鋭なナイフ刃で数条のスジを彫み入れ,2分後に色素を洗い流して固定し、蛍光顕微鏡で観察した。通常の培養下では損傷縁から5〜6細胞列にまで色素が拡散して細胞質が蛍光を発していた。EGTA存在下やフォルスコリン投与では伝幡色素は10細胞列以上に及ぶこともあった。一方高カルシウム存在下やTPA投与後では,2〜3細胞列までに弱い蛍光を認めた。以上のことから、この方法が心筋細胞間の興奮機能伝達における調節因子の作用を検討する上で簡便かつ有用な手段となることが明らかになった。(2)次に心筋細胞におけるギャップ結合構造の形成と分布局在を標識するため特異的抗体の産生を行った。心筋型ギャップ結合膜蛋白コネキシン43のcDNAによるアミノ酸配列から,細胞膜をはさんで外側領域と想定されるN鎖から47ー54の8アミノ酸、および細胞内と想定される101ー113の13アミノ酸のそれぞれ合成ペプチドに対するウサギのポリクロナル抗体を得た。これらは免疫ブロットにより心筋型に特異的認識を示し,肝型とは反応を示さない。細胞内領域標識の抗体は,培養細胞の接着部位および心筋凍結切片の介在板部に蛍光標識を示す。一方細胞外面領域の特異抗体は,培養2〜3日目の接合形成時には,細胞内核周囲などに標識を認めるが,7〜8日目には接合部をアルカリ尿素処理によって離開しないと蛍光が現われず,細胞間の接合形成機構を解析する有力な手段となる可能性が大きく,現在詳細な検討を行っている。

(1) Hearts were removed from adult rats under ether anesthesia, and cells were isolated by thinly cutting and collagenase treatment of the atrium, and cultured in glassware coated with laminin in 10% fetal bovine serum M199 medium in the presence of cytosine arabinoside, and on the 3rd day, the beat of single cardiomyocytes began, and on the 7th to 8th day almost all cells showed pulsating与周围环境同步传输。在存在荧光染料路西法 - 黄色的情况下，将这种状态的培养细胞层用锋利的刀刀片雕刻成几条条纹，在2分钟后，将染料洗净并固定并固定并在荧光显微镜下观察。在正常培养物下，染料从受损的边缘扩散到5-6个细胞行，导致细胞质变成荧光。在EGTA和福斯科蛋白给药的存在下，Denbata染料有时跨越10个细胞系。另一方面，在高钙存在下和TPA给药后观察到弱荧光。从上面可以看出，该方法是研究调节器对心肌细胞之间兴奋功能的影响的方便且有用的工具。（2）然后产生特定的抗体，以标记心肌细胞中间隙连接结构的形成和分布定位。从cDNA的心肌间隙结合膜蛋白连接蛋白43的氨基酸序列中，从N链中获得了47-54的合成肽的兔多克隆抗体，从N链中获得了8个氨基酸，这是外部区域和101-113的氨基酸，并属于101-113。这些通过免疫印迹显示了对心肌类型的特定识别，并且对肝类型没有反应。标记为细胞内区域的抗体在培养细胞的粘附部位和心肌冷冻切片的板间截面上表现出荧光标记。另一方面，当在培养物中第2-3天连接时，在细胞内核的特异性抗体被标记在细胞内核周围，但是如果连接在第7-8天通过碱尿素处理不可分割，则荧光将不会出现，这将不会出现，从而使其成为当前相互分析的细胞形成机构，并进行了详细研究，这是一个很好的工具。