ステロイドホルモンによるmRNA安定化制御の解明

阐明类固醇激素对 mRNA 稳定性的控制

• 批准号: 09278207
• 负责人: 加藤 茂明
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09278207/
• 关键词: mRNA安定化制御; AUUUA配列結合タンパク; β-globin遺伝子; ノザンブロット; Two-hybridシステム; AUF2 結合因子; ステロイドホルモン

現在のところmRNA分解制御の分子メカニズム自体が不明な点が多く、その制御メカニズムを明らかにすることはステロイドホルモン依存的mRNA安定化(不安定化)制御機構解明に向けて必須の課題である。そこで本年度は特に以下の3点に焦点を当て検討した。1)AUUUA配列結合タンパクの機能解析:新規AUUUA配列結合因子(AUF2)のmRNA分解における役割をin vitro mRNA分解活性測定系に導入し検討した。本システムの概要は血清刺激プロモーターに繋いだレポーター遺伝子(β-globin遺伝子)をNIH3T3細胞に導入し、血清刺激により遺伝子産物を一過的に誘導した後、そのmRNAの残存量をノザンブロットにて測定することにより半減期を算出した。2)AUUUA配列結合タンパク共役因子群の検索:AUUUA 配列上に形成される複合体の構成因子を明らかにする目的で酵母を用いたTwo-hybridシステムを導入し、AUF2をbaitにしてヒト脳由来cDNAライブラリーからTwo-hybridスクリーニングによりAUF2とタンパク-タンパク相互作用する共役因子を検索した。3)AUUUA配列結合タンパク共約因子の機能解析:(2)のTwo-hybridスクリーニングによって得られたAUF2結合因子をコードするcDNA断片を用い、ヒト脳由来 cDNAライブラリーから全長cDNAを取得した。得られた全長cDNAを(1)のin vitro mRNA分解活性測定系に導入し、因子の存在下あるいは非存在下においてレポーターmRNAの半減期を測定することによりmRNA分解制御に対するその因子の関与を検討した。更に因子の存在下においてステロイドホルモン存在下および非存在下でも同様にレポーターmRNAの半減期を測定し、ステロイドホルモンの影響も併せて検討した。

当前，分子机制控制mRNA降解有许多未知的方面，澄清调节机制是阐明类固醇激素依赖性mRNA稳定（不稳定）的调节机制的重要问题。因此，今年特别关注以下三个点：1）AUUA序列结合蛋白的功能分析：新型AUUUA序列结合因子（AUF2）在mRNA降解中的作用被引入体外mRNA降解活性分析系统中。该系统的轮廓是引入与血清刺激启动子连接到NIH3T3细胞中的报告基因（β-珠蛋白基因），通过血清刺激暂时诱导基因产物，然后通过North blot测量剩余的mRNA，以计算半寿命。 2）搜索AUUA序列结合蛋白的共价因素：为了阐明在Auuua序列上形成的复合物的组成因子，引入了基于酵母的两性杂交系统，并将AUF2用作诱饵来搜索与蛋白质与蛋白质群体相互作用的共价因子，这些因素与蛋白质群体相互作用。 3）AUUA序列结合蛋白共同还原因子的功能分析：使用编码AUF2结合因子的cDNA片段从人脑衍生的cDNA文库中获得全长cDNA，该cDNA通过（2）中的两个杂交筛选获得。在（1）中将获得的全长cDNA引入了体外mRNA降解活性测定系统中，并通过在存在或不存在因子的情况下测量记者mRNA的半衰期来研究因子参与mRNA降解的调节。此外，在存在因素的情况下，在存在和不存在类固醇激素的情况下测量了记者mRNA的半衰期，还检查了类固醇激素的作用。

项目成果

Yoshizawa,T., Kato,S., et al.: "Impaired bone formation and uterine hypoplasia with growth retardation after weaning in mice lacking the vitamin D receptor." Nature Genetics. 16. 391-396 (1997)

Yoshizawa,T.、Kato,S. 等人：“缺乏维生素 D 受体的小鼠断奶后骨形成受损、子宫发育不全并伴有生长迟缓。”

Takeyama,K., Kato,S., et al.: "25-Hydroxyvitamin D_3 1α-hydroxylase and vitamin D synthesis." Science. 277. 1827-1830 (1997)

Takeyama, K.、Kato, S. 等人：“25-羟基维生素 D_3 1α-羟化酶和维生素 D 合成。科学”277。1827-1830 (1997)

Yamauchi,J., Kato,S., et al.: "Two forms of avian (chicken) TATA-binding protein mRNA generated by alternative polyadenylation." Biochem.Biophys.Res.Commun.234. 406-411 (1997)

Yamauchi,J.、Kato,S. 等人：“通过选择性多聚腺苷酸化生成两种形式的禽类（鸡）TATA 结合蛋白 mRNA。”

Kitanaka,S., Kato,S., et al.: "A new compound heterozygous mutation in the 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 gene in a case of apparent mineralocorticoid excess." J.Clin.Endocrinol.Metab.82. 4054-4058 (1997)

Kitanaka,S.、Kato,S. 等人：“在盐皮质激素明显过量的情况下，11β-羟基类固醇脱氢酶 2 型基因出现新的复合杂合突变。”J.Clin.Endocrinol.Metab.82-。 4058 (1997)

Fujii,H., Kato,S., et al.: "Metabolic inactivation of retinoic acid by a novel P450 differentially expressed in developing mouse embryos." EMBOJ.16. 4163-4173 (1997)

Fujii,H., Kato,S., et al.：“在发育中的小鼠胚胎中差异表达的新型 P450 使视黄酸代谢失活。”