標的遺伝子組換えにみられるジーンコンバージョンの解析

靶向基因重组中观察到的基因转换分析

基本信息

批准号：
05255209
负责人：
権藤洋一
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05255209/
关键词：
相同組換えジーンターゲッティングジーンコンバージョン

项目摘要

マウスES細胞CCE株のp53遺伝子のジーンターゲッティングを行ない、4タイプの組換え導入体を得た。導入実験を独立に2回行ない、得られた全G418耐性株をサザーン法にて解析した。1回目:G418耐性57株の内、相同組換え体13株、重複相同組換え体2株、ランダム導入体35株、ジーンコンバージョン型組換え体7株。2回目:G418耐性58株中、相同組換え体21株、重複相同組換え体2株、ランダム導入体30株、ジーンコンバージョン型組換え体5株であった。ゆえに、4つの導入パターンが、ほぼ同頻度で繰り返し得られることが明らかとなった。また、ジーンコンバージョン型組換え体は全て、5′側のみが相同組換え導入のパターンを示していた。異なるES細胞TT2株にも同様の導入実験を行ない、ほぼ同じ結果が得られ、再現性も確証できた。さらに、得られた全G418耐性株におけるベクターの導入構造を分子レベルにて解析し、次の組換え導入機序モデルを提唱することができた。()内には実際に観察された細胞株数を示している。まず、ベクターの導入は5′側の相同領域でホリデイ構造が作られる。この確率はランダムに導入してG418耐性となる場合の約半分(50/115)である。その場合、3′側相同領域でもホリデイ構造を作る確率が75%(38/50)で、2箇所の組換えにより相同組換えにより相同組換え体となる。ただし、このうち約10%(4/38)ハ、ベクターがタンデムに重複され重複相同組換体となる。さて残りの25%(12/50)では、3′側はホリデイ構造を作らずブルースクリプトも含めて、ターゲッティングベクターの5′末端と環状形で相同組換え導入される。これがジーンコンバージョン型組換え導入のモデルである。これは、Capecchiにより提唱されている1箇所の相同組換えによる「挿入型」ジーンターゲッティングに相当する。以上、組換え導入を分子レベルで解析した結果、再現性の高いジーンターゲッティング系が初めて確立でき、実験的に検証可能な遺伝子導入機序モデルも提唱できた。

进行小鼠ES细胞CCE菌株的p53基因的基因靶向以获得四种类型的重组转染物体。引言实验是独立两次进行的，并使用Southern方法分析了所有结果的G418抗性菌株。第一次：在57种G418抗性菌株中，有13种同源重组剂，2种重叠的同源重组剂，35种随机诱导菌株和7种基因转换重组剂。第二次：在58种G418抗性菌株中，有21种同源重组剂，2种重叠的同源重组剂，30个随机诱导剂和5种基因转换重组剂。因此，已经揭示了可以以大致相同频率重复获得四种引入模式。此外，所有基因转化型重组剂仅在5'侧都表现出同源重组介绍的模式。在不同的ES细胞TT2菌株上进行了类似的引入实验，并获得了几乎相同的结果，并确认了可重复性。此外，在分子水平上分析了所有G418抗性菌株中的矢量引入结构，并可以提出以下重组引入机理模型。实际观察到的细胞系数显示在（）中。首先，矢量的引入是在5'侧的同源性区域进行的，并创建了假日结构。该概率约为G418电阻的随机引入的一半（50/115）。在这种情况下，即使在3'同源区域中创建假日结构的可能性为75％（38/50），并且在两个位置通过同源重组获得同源重组。然而，其中约10％（4/38）的矢量串联重叠，导致重复的同源重组。在其余的25％（12/50）中，3'侧不会产生假日结构，并以圆形形式重新组合，并以目标向量的5'末端（包括蓝色脚本）形成。这是引入基因转化类型重组的模型。这对应于Capecchi提出的单个位置同源重组的“插入”基因靶向。通过分析分子水平的重组引入的结果，首次建立了高度可重现的基因靶向系统，还提出了一个实验可验证的基因靶向模型。